Восстановление клеток, поврежденных УФ ‑излучением, является сложнейшим процессом, совершенствующимся с момента зарождения живого. На ранних этапах развития жизни наличие интенсивного УФ - излучения, в том числе и коротковолнового (вследствие отсутствия атмосферных экранов), привело к развитию мощных, репарирующих УФ -повреждения, внутриклеточных систем, которые в настоящих условиях для большинства клеток многоклеточных животных являются избыточными. При достаточно низкой интенсивности облучения репарационные процессы в клетке успевают устранять возникающие повреждения раньше, чем их количество превысит некоторое "критическое" значение, приводящее к появлению нерепарабельных нарушений. Клеточные системы успевают закончить репарацию генома за время, измеряющиеся несколькими часами, но для отдельных, наиболее активных сайтов ДНК, репарация тиминовых димеров происходит значительно быстрее. Время, в течение которого внешние воздействия могут изменить интегральный ответ клетки на импульсное повреждающее воздействие, связано с процессами репарации. Для УФ ‑повреждённых кератиноцитов кожи это время (судя по результатам ингибиторного анализа) составляет десятки минут. Повреждающее воздействие можно считать "импульсным" (однократным) в том случае, если его длительность меньше времени, в течение которого определяется судьба повреждённой клетки. Есть основания считать, что для некоторых ответов клетки на УФ -повреждение это время измеряется секундами. Если по критерию МЭД закон взаимозаменяемости интенсивности и времени облучения для УФ ‑эритемы выполняется в интервале от долей до сотен секунд, то эритема от дозы, превышающей МЭД, возрастает с ростом интенсивности. Количественно это выражается в том, что при возрастании интенсивности облучения полным спектром лампы ПРК-2 на 3 порядка, тангенс угла наклона дозовой зависимости увеличивается более чем в 3 раза.
Современные знания о клеточных механизмах позволяют утверждать, что, кроме репарации клетки, существует ещё один вариант физиологического ответа клетки на повреждение - апоптоз, который препятствует "патологической" гибели клетки по механизму некроза. Программа элиминации клетки механизмом апоптоза включается при невозможности полной репарации. Повреждение при этом не должно превысить порог, при котором происходит поломка программы апоптоза. В последнем случае гибель клетки происходит по механизму некроза с формированием воспалительной реакции. Для УФ ‑излучения в качестве поглощённой дозы традиционно измеряют энергию, падающую на единицу поверхности облучаемого объекта, то есть поверхностную плотность дозы. Это возможно по той причине, что наиболее биологически активная часть УФ ‑излучения поглощается поверхностными слоями кожи. В промежутке между дозами повреждения, приводящими клетку к "чистому" апоптозу или к некрозу, возможна (при дозе УФВ излучения около 350 Дж/м 2) реализация программы апоптоза с "изменённой морфологией" или "провоспалительного апоптоза", который происходит при модификации программы апоптоза, вероятно, тем же самым повреждающим воздействием, которое и вызвало апоптоз. Экспериментально провоспалительный апоптоз был обнаружен в работе (Caricchio R e.a., J Immunol. Dec 2003). Бимодальность действия УФ -излучения на кератиноциты (немонотонная дозовая зависимость апоптоза) показана также и в других работах. Но природа этих явлений не установлена. Наиболее вероятной представляется модель, согласно которой исход УФ облучения кератиноцитов кожи определяется количеством (долей) УФ - поврежденных митохондрий. Данные предположения подтверждаются особенностями дозозависимой кинетики двухкомпонентной УФВ -эритемы кожи. Опыты на культуре человеческих кератиноцитов показывают, что при УФС -облучении производится значительно большее количество фотопродуктов (CPDs и (6-4)PPs), а приблизительно равный апоптогенный эффект УФС и УФВ излучений обусловлен тем, что УФВ облучение активирует не только митохондриальный, но и caspase-8 зависимый путь активации апоптоза (Takasawa R e.a., PubMed - in process Oct 2005). Важнейшей задачей является исследование связи УФ -индуцированного апоптоза с эритемогенезом, но при этом следует учитывать особенности поглощения УФ излучения в различных слоях кожи. Установление связи УФ -индуцированного апоптоза с эритемогенезом позволит разработать неинвазивный метод диагностики параметров системы апоптоза. В настоящее время особое внимание должно уделяться разработке методов диагностики, основанных на анализе развивающихся во времени реакций систем организма на какое-либо (внешнее) воздействие. Разрабатываемый метод диагностики характеризуют дешевизна, неинвазивность, абсолютная стерильность и возможность оказывать физиологическое, строго дозированное тестирующее воздействие на кожные и другие покровы.
Библиографическая ссылка
Бондырев Ю.А. АНАЛИЗ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УФ ИЗЛУЧЕНИЯ КАК ТЕСТИРУЮЩЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ // Современные проблемы науки и образования. – 2006. – № 2.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=183 (дата обращения: 05.01.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
Приборы для фиксации оптических спектров построены по единому принципу. В качестве источника УФ излучения обычно применяется "водородная лампа" (электрический разряд в атмосфере водорода при низком давлении), которая дает практически непрерывный спектр излучения в области 190-360 нм.
Для работы в видимой области служит лампа накаливания с вольфрамовой спиралью. Излучение от источника попадает в монохроматор, состоящий из зеркала, кварцевой призмы и щели. Отражаясь от зеркала, свет разлагается призмой или дифракционные решетки и затем с помощью щели из спектра выделяется узкая область. При вращении призмы спектр перемещается по отношению к щели, что позволяет получать лучи света со строго определенной длиной волны, обычно с точностью ±0,5 нм. Монохроматическое излучение пропускается через кварцевую кювету, содержащую раствор исследуемого вещества в прозрачном для УФ- области растворителе. Толщина кювет 1-10 см, наиболее распространенные кюветы имеют сечение 1´1 см, и для их заполнения требуется около 3 мл раствора. Интенсивность прошедшего через кювету света измеряется с помощью фотоэлемента, величина тока которого пропорциональна интенсивности падающего света. Ток усиливается и регистрируется потенциометром.
Сравнивается интенсивность светового луча, прошедшего через исследуемый раствор, и луча, пропущенного через аналогичную кювету с чистым растворителем. Получаемая разность соответствует поглощению растворенного исследуемого вещества.
Такое сравнение может быть проведено двумя путями. При наличии одного светового луча на его пути попеременно ставят кювету с исследуемым раствором и с растворителем (кювету сравнения). Спектр строят по точкам, постепенно вручную настраивая прибор на определенные длины волн. В современных регистрирующих приборах световой поток делится на два одинаковых пучка, один из которых проходит через исследуемый раствор, а другой - через растворитель, причем как сравнение интенсивностей прошедших через кюветы световых потоков, так и непрерывное изменение длин волн производится автоматически. В том и другом случае получают спектр вещества, представляющий собой зависимость оптической плотности раствора (D) от длины волны поглощаемого света:
В точках максимумов молярный коэффициент погашения вычисляют по формуле
Спектр в большинстве случаев представляет собой кривую с одним пологим максимумом. Большая ширина полосы поглощения обусловлена тем, что помимо основных уровней электронных переходов существуют подуровни, связанные с колебаниями молекулы. Многочисленность таких подуровней обычно приводит к тому, что соответствующие им отдельные максимумы сливаются в один, имеющий пологую форму. В отдельных случаях, например для ароматических соединений, за счет колебательных подуровней максимум поглощения представляет собой набор узких полос по обе стороны от основной. В таких случаях принято говорить, что максимум имеет тонкую структуру.
Приборы различных схем позволяют получать спектры в различных областях спектра. В УФ области поглощают все органические вещества. Длины волн менее 190 нм (дальняя, или вакуумная область УФ спектра) малопригодны для работы, так как в этой области поглощают компоненты воздуха - кислород и азот. Приборы для исследований в интервале длин волн 120-190 нм с вакуумными камерами существуют, однако они сложны и редко используются в обычной лабораторной практике; существуют схемы, где влияние газов воздуха ликвидируют продувкой полостей, по которым проходит луч непоглощающим газом.
Для волн длиной более 200 нм воздух прозрачен, что делает ближнюю ультрафиолетовую и видимую области спектра (190-800 нм) удобными для измерений. В том же интервале прозрачен кварц, который в УФ спектроскопии применяется как оптический материал для изготовления призм и кювет. Приборы для получения спектров поглощения в этой области просты и доступны. Необходимые для исследования количества вещества невелики - около 0,1 мг. В связи с этим УФ спектроскопия в настоящее время является одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования органических соединений.
Поглощение органическими веществами электромагнитных колебаний в ультрафиолетовой (УФ) и видимой области обусловлено переходом электронов со связывающих орбиталей на разрыхляющие или несвязывающие орбитали; такое состояние молекулы называется возбужденным.
При взаимодействии с квантом света электрон, поглощая энергию, может переходить с высшей заполненной орбитали на низшую вакантную орбиталь. Электроны достаточно прочно удерживаются ядром, поэтому для их возбуждения требуются большие энергии и, следовательно, электромагнитное излучение, имеющее малые длины волн (120 - 800 нм).
Электроны в атомах и молекулах занимают орбитали со строго определенной энергией. Уровень энергии атомных орбиталей определяется соответствующим набором квантовых чисел. Молекулярные орбитали могут рассматриваться как линейные комбинации атомных. Такая комбинация дает связывающую орбиталь (¯ , электроны с антипараллельными спинами, нормальное состояние) и разрыхляющую орбиталь ( , электроны с параллельными спинами, возбужденное состояние).
В обычных органических молекулах присутствуют электроны s - и p -связей, а также электроны неподеленных пар гетероатомов, или n -электроны. Их относительные энергетические уровни и сравнительные энергии возможных переходов в возбужденное состояние представлены на рис. 4, из которого следует, что наибольшая энергия кванта необходима для осуществления перехода s®s* , т.е. для возбуждения электронов наиболее прочной s -связи необходимы кванты света минимальной длины волны. Энергия переходов n®s* и p®p* меньше, и, следовательно, длина волны света, возбуждающего такой переход, соответственно больше. Энергия n -уровня электронов выше энергии p -уровней, поэтому возбуждение вызывается квантами света еще большей длины волны. Практическое значение имеют переходы n ®p* и p®p* , поскольку только им соответствуют длины волн, попадающие в рабочий диапазон прибора. Исключение составляют переходы p®p* изолированных двойных связей С=С и C=N , а также тройных связей и (l макс 160-180 нм). Для изолированных кратных связей в используемом для измерений интервале проявляется только переход карбонильной группы С=О (l макс » 270 нм).
Группировки, вызывающие избирательное поглощение электромагнитного колебания в УФ- области, называются хромофорами . Основными хромофорами, дающими максимум поглощения в области 200-800 нм, являются системы сопряженных двойных связей. Орбитали, образуемые двумя сопряженными двойными связями, представлены на рис. 5.
Из рисунка очевидно, что при взаимодействии двух p - орбиталей, соответствующих изолированным двойным связям, образуются две новые орбитали: связующая (p+p ) и разрыхляющая (p-p ). Возбужденному состоянию также соответствуют две орбитали. Следовательно, для возбуждения электронов сопряженной системы, т.е. для осуществления перехода с высшей заполненной (p-p ) на низшую вакантную (p*+p* ) орбиталь, требуется меньшая энергия, чем для возбуждения электронов изолированных двойных связей (p®p* ), так что сопряженные двойные связи будут поглощать кванты света с большей длиной волны, чем изолированные двойные связи. С ростом числа сопряженных двойных связей энергия, необходимая для возбуждения электронов, будет уменьшаться, и поглощение света будет наблюдаться при больших длинах волн.
Интенсивность поглощения в спектре связана с вероятностью данного типа электронного перехода. Однако далеко не все переходы, формально кажущиеся возможными, осуществляются в действительности. Существуют так называемые правила отбора, определяющие разрешенные и запрещенные переходы. Эти правила учитывают в основном симметрию молекулы, а также электронную симметрию основного и возбужденного состояний; запрещены переходы, при которых происходит изменение спина электрона. Интенсивность поглощения, соответствующего разрешенным переходам, обычно высока, мольный коэффициент погашения достигает тысяч, а иногда и сотен тысяч единиц, тогда как для запрещенных переходов значение e составляет десятки, реже - сотни единиц.
Различные области спектра дают различную информацию. УФ спектры дают важную информацию о наличии кратных и сопряженных связей, ИК спектры позволяют наблюдать многочисленные проявления различных молекулярных группировок, ЯМР- и ЭПР- спектры позволяют исследовать тонкие детали механизмов взаимодействия в реакциях. Поэтому всегда важно использовать различные спектральные методы в комплексе.
Изучение УФ спектров
Электронные уровни наглядно и с высокой точностью описываются в терминах теории молекулярных орбиталей. Исходя из деталей взаимодействия и данных о потенциалах ионизации можно расположить электроны различных молекулярных орбиталей в следующий ряд по их энергии: s
Наличие и интенсивность проявления линии в спектре определяется вероятностью или разрешенностью соответствующего перехода. Для описания спектров используют следующие правила:
а) поглощение одного кванта сопровождается возбуждением одного электрона;
б) суммарное спиновое число при электронном переходе должно остаться неизменным.
Есть правила, учитывающие симметрию молекулы и симметрии основного и возбужденного состояний, но они не столь всеобщи. Во всех устойчивых молекулах электроны всегда спарены, возбуждение переносит электрон на более высокий по энергии уровень, но спин его остается противоположным спину электрона оставшегося. Системы, содержащие только спаренные электроны, называют синглетными ; системы, в которых присутствуют неспаренные электроны - триплетными . Переходы между синглетными или триплетными уровнями разрешены и проявления в спектрах интенсивны (триплетные уровни заселены слабо и соответствующие линии слабы только поэтому), переходы между синглетным и триплетным уровнями, наоборот, запрещены и линии, им соответствующие, малоинтенсивны.
В молекулах можно выделить структурные фрагменты, обуславливающие избирательное поглощение излучение и называемые хромофорами и фрагменты, вступающие в электронное взаимодействие с хромофорами , изменяющие таким образом интенсивность поглощения и/или положение максимума и называемые ауксохромами . Выделяют следующие типы влияния ауксохрома:
а) батохромный сдвиг - смещение полосы поглощения в сторону более длинных волн (меньших частот) или красный сдвиг;
б) гипсохромный сдвиг - смещение в сторону более коротких волн (больших частот) или синий сдвиг;
в) гиперхромный эффект - увеличение интенсивности поглощения;
г) гипохромный эффект - понижение интенсивности поглощения
УФ спектр органического вещества характеристичен, так как поглощение определяется только собственно хромофором и его ближайшим окружением, т. е. один и тот же хромофор проявляется практически одинаково как в относительно простых, так и в самых сложных молекулах. В зависимости от непосредственного окружения одной и той же хромофорной группировки положение максимума поглощения в УФ спектрах различных соединений может несколько изменяться. Сдвиг максимума в сторону более длинных волн принято называть батохромным сдвигом, а сдвиг в сторону более коротких волн - гипсохромным. Замена растворителя в отдельных случаях может вызвать некоторые изменения как в положении полос (на 2- 10 нм), так и в их интенсивности (на 10-20%).
Как правило, такая замена влияет на спектры полярных веществ и практически не сказывается на УФ спектрах неполярных соединений. Наиболее сильные изменения в спектрах обусловлены химическим взаимодействием вещества с растворителем (в частности, образованием водородной связи), а также изменением степени диссоциации или соотношения таутомерных форм вещества. Во всех таких случаях следует проверить, выполняется ли для данного раствора закон Бугера-Ламберта-Бера.
Таким образом, УФ спектроскопия позволяет определить в исследуемых соединениях группировки-хромофоры и дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки. Как структурно-аналитический метод УФ спектроскопия значительно менее информативна по сравнению с другими методами и носит в основном эмпирический характер, поскольку зависимость между характером поглощения и структурой молекулы не имеет строгого физико-математического обоснования, что, однако, не мешает широкому использованию метода.
Отсутствие в УФ спектре исследуемого вещества максимума поглощения в области 200-800 нм служит надежным доказательством того, что в этом веществе не содержатся сопряженные диеновые или полиеновые системы, ароматические ядра и карбонильные группы. Этот признак часто оказывается полезным при установлении структуры соединения, например, позволяет легко различить изомеры с сопряженными и изолированными двойными связями, как в случае приводимой ниже пары:
УФ спектры основных гетероциклических соединений представлены ниже:
Таким образом, достаточно очевидны как преимущества метода (доказательство наличия в исследуемом веществе группировок-хромофоров сопряженной диеновой, полиеновой и ароматической систем, а также карбонильной группы или их отсутствия; в простейших случаях возможность определения типа хромофора, длины цепи сопряжения, числа алкильных групп при хромофоре; количественный анализ, включая регистрацию изменения концентраций растворов во времени), так и ограничения метода (ограниченность рамок применения, так как многие типы органических соединений не имеют максимума поглощения в исследуемой области; сравнительно малые возможности при решении структурно-аналитических задач; в ряде случаев сильное влияние природы растворителя на характер спектра и возможность отклонений от закона Бугера- Ламберта-Бера; фотохимическая изомеризация веществ в процессе работы (например, цис-транс- изомеризация в диеновых и полиеновых системах).
Фотометрические (абсорбционные) методы анализа основа-ны на способности анализируемого вещества избирательно по-глощать свет.
Анализ веществ, основанный на измерении светопоглощё-ния, включает спектрофотометрию и фотоколориметрию.
Спектрофотометрия основана на поглощении монохромати-ческого света, т. е. света определенной длины волны (1-2 нм) в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра.
Такого рода измерения поглощения света осуществляются при помощи спектрофотометров различных марок, в которых используется всегда монохроматический поток световой энер-гии, получаемый посредством оптической системы, называемой монохроматором.
Поглощение в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра связано в основном с возбуждением электронов.
Поглощение света в инфракрасной области спектра (ИК) обусловлено молекулярными колебаниями.
В зависимости от диапазона длин волн, при которых измеряют светопо-глощение растворов химических ве-ществ, методы, основанные на измере-нии светопоглощения, подразделяются на спектрофотометрию в УФ-области спектра с диапазоном длин волн 200- 400 нм, спектрофотометрию в види-мой области спектра (400-760 нм) и спектрофотометрию в инфракрасной области спектра (760-20 000 нм). Но обычно единицей измерения длин волн ИК-спектров является микрон (1 мк= = 10 -4 см) или волновое число (см -1), т. е, число волн в 1 см.
В фармацевтическом анализе чаще используется спектроско-пия в УФ- и видимой области спектра.
Метод УФ-спектроскопии включен в ГФ IX, ГФ X и МФ II, а также в последние издания фармакопеи почти всех стран для определения подлинности, чистоты и количественного опреде-ления вещества в препаратах.
Абсорбционный спектр или спектр поглощения представляет собой графическое изображение количества света, поглощенно-го веществом при определенных значениях длин волн.
Для построения характеристической кривой поглощения - величины длин волн (Я,) при УФ-спектроскопии или волновые числа (см -1) при ИК-спектроскопии - наносят на ось абсцисс, а величину погашения (Л) 1 или проценты пропускания (Г) (при ИК-спектроскопии) - на ось ординат (рис. 5, 6).
При построении кривых спектров погашения в УФ- и види-мой части спектров можно использовать величины удельных показателей погашения (Ј 1% i CM) или молярного показателя поглощения (е) 2 , где е - оптическая плотность 1 М раствора ве-щества при толщине слоя в 1 см; Ј 1% i CM - величина погашения раствора, содержащего 1 г вещества в 100 мл раствора при тол-щине слоя в 1 см.
Эти величины определяются экспериментально, для многих веществ они приведены в литературе.
Характеристикой спектра поглощения является положение максимумов (минимумов) поглощения света веществом, а так-же интенсивность поглощения, что характеризуется оптической плотностью (D ) или удельным показателем поглощения (Ј 1% 1см) при определенных длинах волн.
УФ-спектрофотометрическое измерение проводят обычно в растворах. В качестве растворителей используется дистиллиро-
ванная вода, кислоты, щелочи, спирты (этиловый, метиловый) и некоторые другие органические растворители.
Растворитель не должен поглощать свет в той области спектра, что и исследуемое вещество. Характер спектра может изменяться в различных растворителях, а также при изменении рН среды.
Факторами, обусловливающими поглощение света исследуе-мыми веществами, является наличие в их молекулах так назы-
Каждая функциональная группа в молекуле вещества ха-рактеризуется поглощением света в определенной области спектра, что и используется для целей идентификации и коли-чественного определения вещества в препарате.
Кроме хромофоров, в состав молекулы могут входить функ-циональные группы, которые сами по себе не поглощают в близ-ком ультрафиолете, но могут влиять на поведение сопряжен-ного с ними хромофора. Такие группы, называемые ауксохро-мами, обычно вызывают появление поглощения при больших длинах волн и с большим значением коэффициента погашения, чем это свойственно данному хромофору. Примеры ауксохро-мов: -SH, -NH 2 , -ОН.
ИК-спектры для большинства органических соединений, в отличие от УФ-спектров, характеризуются наличием большего числа пиков поглощения (см. рис. 6). Поэтому метод ПК-спект-роскопии дает возможность получить наиболее полную инфор-мацию о строении и составе анализируемого вещества, позво-ляющую идентифицировать очень близкие по структуре соеди-нения.
В ГФ X и МФ II метод ИК-спектроскопии принят для иден-тификации многих органических лекарственных веществ с по-лифункциональными группами в их молекулах путем сравнения со спектрами стандартных образцов, снятых в одинаковых ус-ловиях. В оригинальной литературе последних лет приведены! ИК-спектры антибиотиков, гормонов, кумаринов и многих дру-гих Лекарственных веществ органической природы. В связи с-возрастающими требованиями к качеству лекарств ИК-спектро-скопия как один из надежных методов идентификации приобре-тает все большее значение.
Два других вида спектроскопии, часто применяемые в органической химии, - ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия и масс-спектрометрия (МС). В этой книге мы не будем подробно на них останавливаться и не будем заниматься интерпретацией спектров, а ограничимся лишь знакомством с основными принципами и характером информации, которую дают эти типы спектроскопии.
Ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия изучает поглощение органическими веществами света в ультрафиолетовой области спектра (длина волны от 200 до 400 нм). Излучение с такой длиной волны поглощают только соединения, содержащие -связи (например, группы или Поглощение вызвано электронными переходами внутри молекулы. Для молекул, имеющих -связи, энергетическая разница между основным и возбужденным электронными состояниями соответствует энергии фотонов УФ-излучения. УФ-Излучение вызывает переход электронов на более высокую по энергии молекулярную орбиталь. При этом световая энергия переходит в энергию молекулы.
УФ-Спектр обычно состоит из одной широкой полосы поглощения, положение которой указывает на окружение двойной связи в молекуле. Чем большее число двойных связей в молекуле образует цепь сопряжения, тем больше длина волны поглощаемого света. Термин сопряжение означает, что две двойные связи разделены одной простой связью. В табл. 114 показано положение максимумов поглощения некоторых типичных структур. На рис. 11-22 изображен УФ-спектр -циклогексадиена.
Из табл. 11-4 видно, что появление в цепи сопряжения новой двойной связи увеличивает длину волны поглощаемого УФ-излучения примерно
Рис. 11-22. Уф-Спектр 1,3-циклогексадиена
Таблица 11-4. (см. скан) Положение максимумов поглощения УФ-излучения для некоторых соединений
на 30-50 нм. Обратите также внимание, что вещества, не имеющие двойных связей, не поглощают УФ-излучения.
Если в молекуле имеется цепь сопряжения, состоящая из семи или более двойных связей, то такое вещество поглощает видимый свет (длина волны 400-700 нм) и является окрашенным благодаря избирательному поглощению некоторых цветов.
Ультрафиолетовая спектроскопия позволяет определять число сопряженных углерод-углеродных и углерод-кислородных двойных связей в молекуле. Поглощение возникает вследствие электронных переходов.
Благодаря простоте аналитических операций и, в большинстве случаев, высокой чувствительности метод нашел широкое применение в фармацевтическом анализе.
УФ-спектрофотометрия используется при установлении подлинности (идентификации), доброкачественности, количественном определении, как индивидуальных веществ, так и компонентов лекарственных форм; испытании по тестам “Растворение” и “Однородность дозирования”.
Метод применяется на таких стадиях изучения лекарственных веществ и лекарственных форм как фармакокинетика, биодоступность, изучение стабильности и установление сроков годности.
Испытание на подлинность лекарственных веществ. В основе этой стадии фармацевтического анализа лежат следующие приемы:
а) нахождение в спектре λ max и λ min , характеризующих области максимального и минимального поглощения;
б) вычисление отношения значений оптических плотностей исследуемого раствора при разных длинах волн;
в) характеристика интенсивности поглощения по величине удельного показателя (Е);
г) сравнение спектра анализируемого вещества со спектром стандартного образца этого же вещества.
Во всех случаях необходимо получение спектра в условиях, приведенных в НД – растворитель, концентрация, интервал длин волн, размер (толщина) кюветы.
Для случая (а) в полученном спектре находят λ max и λ min , сравнивают с такими же характеристиками, приведенными в НД – при идентичности веществ оба значения должны совпадать (табл.7).
Удобным приемом при испытании на подлинность является определение отношения величин поглощения при двух максимумах. Это уменьшает влияние переменных характеристик прибора на испытание и исключает необходимость использования стандартного образца. Такой способ используют в случае анализа натрия пара-аминосалицилата натрия
Таблица 7
Характеристика уф-спектров, используемая при идентификации некоторых лекарственных веществ в фармакопейном анализе
|
№ п/п |
Лекарствен-ное вещество |
Концентрация и растворитель |
Характеристика, используемая для идентификации |
|
Амлодипина бесилат |
0,005% в 1% растворе 0,1 М HClв метаноле |
λ max = 360 ± 2нм; Е= 113-121 |
|
|
Аминазин |
0,0005% в 0,01 М HCl |
λ max = 254±2нм, 307±2нм |
|
|
Анестезин |
0,0005% в 0,1 М NaOH |
λ max = 281±2нм; λ min = 238±2нм |
|
|
Верапамила гидрохлорид |
0,002% в 0,01 М HCl |
D 229 = 0,61 – 0,64 D 278 = 0,23 – 0,24 |
|
|
Дексаметазон |
0,001% в 95% спирте |
λ max = 240±2нм; D 240нм /D 263нм = 1,9 – 2,1 |
|
|
0,002% в 95% спирте |
λ max =244±2нм, 275±2нм, 281±2нм; λ min =230±2нм, 259±2нм, 279±2нм; приведен рисунок спектра |
||
|
Димедрол |
0,05% в 95% спирте |
λ max =253±2нм, 258±2нм, 264±2нм; λ min =244±2нм, 255±2нм, 263±2нм |
|
|
Дротаверина гидрохлорид |
0,0015% в 0,1 М HCl |
λ max =241±2нм,302±2нм,353±2нм; λ min =223±2нм,262±2нм,322±2нм |
|
|
Зопиклон |
0,001% в 0,1 М HCl |
λ max =303±2нм; D 303 =0,340-0,380 |
|
|
0,0006% раствор 2,4-динитрофенилгидразона камфоры в 95% спирте этиловом |
λ max = 231±2нм, 265±2нм; плечо в области от 273 нм до 277 нм |
||
|
Кислота аскорбиновая |
0,001% в буферном растворе с рН 7,0 |
λ max =265±2нм |
|
|
Кислота никотиновая |
0,002% в 0,1 М NaOH |
λ max =258±2нм, 264±2нм, 270±2нм; λ min =240±2нм; в области от 240нм до 256нм наблюдаются два неидентифицированных плеча |
|
|
Кислота фолиевая |
0,001% в 0,1 М NaOH |
Полное совпадение со спектром ГСО в области от 230 до 380 нм |
|
|
Нитроксолин |
0,0005% раствор в смеси 95% спирт – буферный раствор с рН 9,18 (98:2) |
λ max =249±2нм, 341±2нм, два плеча в области от 228нм до 238нм и от 258нм до 268нм |
|
|
Офлоксацин |
0,001% в 0,1 М HCl |
λ max = 226±2нм, 295±2нм; λ min = 265±2нм |
|
|
Папаверина гидрохлорид |
0,0025% в 0,01 М HCl |
λ max = 285±3нм, 309±2нм; λ min = 289±2нм |
|
|
Пирацетам |
1% водный раствор |
Не имеет выраженных максимумов поглощения в области от 230нм до 350нм |
|
|
Прогестерон |
0,001% в 95% спирте |
λ max = 241±2нм; Е= 518-545 |
|
|
Ранитидина гидрохлорид |
0,01% водный раствор |
λ max = 229±2нм; 315±2нм; D 229нм /D 315нм = 1,01 – 1,07 |
|
|
Сульфа-диметоксин |
0,000015% в NaOH 0,000015% в HCl |
Спектр щелочного раствора препарата, снятый относительно кислого раствора имеет λ max =253±2нм, 268±2нм; λ min = 260±2нм; Спектр кислого раствора препарата, снятый относительно щелочного раствора, имеет λ max =288±2нм |
|
|
Тамоксифена цитрат |
0,002% в метаноле |
λ max =237нм, 275нм |
|
|
Фамотидин |
0,0025% в фосфатном буфере |
Полное совпадение со спектром РСО в области от 230нм до 350нм |
|
|
Фуразолидон |
0,0015% в ДМФА |
λ max =260±2нм, 367±2нм; λ min =302±2нм |
|
|
Фурацилин |
0,0006% в ДМФА |
λ max =260±2нм, 375±2нм; λ min =306±2нм |
При испытании на подлинность часто рекомендуется рассчитать Ев максимуме поглощения (например, для левомицетина, адреналина, прогестерона) или сравнить найденное значение оптической плотности в определенном диапазоне длин волн со значениями, приведенными в НД. Так спектр поглощения раствора пиридоксина гидрохлорида в фосфатном буферном растворе (рН = 6,9) с концентрацией 0,5 мг/мл в области от 230 до 250 нм имеет максимумы при 254 и 324 нм, а оптическая плотность при этих максимумах равна соответственно 0,18 и 0,35.
Некоторые испытания на подлинность с использованием УФ-спектрофотометрии требуют применение стандартных образцов (СО) лекарственных веществ. В этом случае проба СО должна быть приготовлена и одновременно определена в тех же условиях, что и испытуемое вещество. Так, УФ-спектр 0,0005% раствора этинитэстрадиола в спирте этиловом должен иметь максимумы и минимумы при тех же длинах волн, что и раствор СО одинаковой концентрации, соответствующие величины поглощения, рассчитанные на сухое вещество при λ max = 281 нм не должны отличаться более, чем на 3%. Такой прием обеспечивает более достоверные результаты, чем при анализе спектра только одного исследуемого соединения.
УФ-спектрофотометрия является также одним из составных комплекса спектральных методов исследования новых биологически активных веществ. Определенные полосы поглощения в спектре могут указать на наличие в структуре этого соединения тех или иных функциональных групп, фрагментов структур (хромофоров). Этим объясняется сходство спектров веществ, содержащих фенильный радикал, например, эфедрина, димедрола, атропина, бензилпенициллина. Они имеют три максимума поглощения: 251, 257 и 263 нм (рис.7).
Лекарственные вещества, содержащие замещенный ароматический радикал – адреналин, морфин, эстрадиол, левомицетин и др. – имеют в спектре один максимум около 260 нм, сопряженную еноновую систему в лекарственных веществах из группы кортикостероидов – около 238 нм (рис.8).
У некоторых лекарственных веществ (производные барбитуровой кислоты, сульфаниламиды, фенолы, некоторые производные пурина и др.) характер спектра может изменяться в зависимости от рН раствора (рис. 9, 10, 11, 12, 14). При этом изменяется λ max (батохромное смещение), усиливается поглощение (увеличивается величина оптической плотности), наблюдается гиперхромный эффект. Кофеин не проявляет кислотных свойств, поэтому максимум поглощения у него в кислой и щелочной среде при одной и той же длине волны – 272 нм (рис. 13). То есть, УФ-спектрофотометрия может дать информацию об определенных свойствах исследуемого вещества.
Одназначного вывода о структуре химического соединения с помощью УФ-спектрофотометрии сделать невозможно, так как интерпретация спектра затруднена из-за присутствия в молекуле более чем одного хромофора. Тем не менее метод позволяет определить некоторые группировки – хромофоры и сделать вывод о характере и степени сопряжения (с удлинением цепи сопряжения наблюдается смещение максимума поглощения в более длинноволновую область, рис.11).
УФ-спектрофотометрия используется для изучения свойств органических соединений: способности к образованию водородной связи, определения рК а кислот и оснований, определения состава и свойств комплексных соединений лекарственных веществ, изомерии.
Цис- и транс- изомеры имеют отличные друг от друга спектры. Транс-форма обычно поглощает сильнее и полоса ее поглощения сдвинута в длинноволновую область; этот факт может служить доказательством изменения структуры в ходе реакции.
Однако, УФ-спектры не дают каких-либо сведений о строении исследуемого вещества, т.к. они позволяют установить лишь наличие хромофоров и гетероатомов.
Кроме того, УФ-спектрофотометрия дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки.
При испытании на доброкачественность (чистоту) используют те же характеристики, что и при идентификации. При наличии примесей может изменяться λ max , появляться дополнительные максимумы, изменяться интенсивность поглощения.
Специфические примеси, присутствующие в лекарственных веществах, как правило, имеют близкое химическое строение с исследуемым веществом. Поэтому особый интерес представляют случаи, когда лекарственное вещество и его специфическая примесь поглощают при разных длинах волн.
Например, λ max адреналина (Ι) располагается при 278 нм, а его специфическая примесь – адренолон (ΙΙ) имеет максимум поглощения при 310 нм.
Согласно требованию фармакопейной статьи, в 0,05% растворе адреналина, приготовленном для испытания на чистоту, оптическая плотность при 310 нм не должна превышать 0,1 (т.е. в адреналине допускается строго нормируемое содержание адренолона).
Количественное определение. Принцип количественного определения методом УФ-спектрофотометрии заключается в следующем: навеску анализируемого образца (субстанция, лекарственная форма и др.) растворяют в подходящем растворителе, если необходимо, дополнительно готовят разведение полученного раствора и измеряют его оптическую плотность при длине волны, указанной в методике. Концентрацию (содержание) анализируемого вещества находят одним из описанных ранее способов (п. 1.2.3.4).
В соответствии с современными требованиями для таблеток, драже, сухих лекарственных средств для инъекций и лекарственных веществ в капсулах с содержанием действующего вещества 0,05 г и менее обязательным является испытание на однородность дозирования, т.е. содержание вещества в каждой отдельной дозе. Для такой оценки, особенно в случае содержания действующего вещества в мг или его долях (таблетки клофелина содержат 0,075 и 0,15 мг действующего вещества) требуется применение высокочувствительного метода. Таким в большинстве случаев и является УФ-спектрофотометрия.
Актуальным является исследование биодоступности лекарственных веществ. Определенной ее характеристикой является тест “Растворение” (ГФ ΧΙ, вып. 2, с.154). УФ-спектрофотометрия, отличающаяся, как правило, высокой чувствительностью является одним из наиболее часто используемых для этой цели методов (табл.8).
Ниже приводятся методики анализа некоторых лекарственных веществ спектрофотометрическим методом в УФ-области, а в табл.8 приведен ряд примеров использования метода УФ-спектрофотометрии в фармакопейном анализе.