Obnavljanje stanica oštećenih UV zračenjem složen je proces koji se poboljšava od rođenja života. U ranim stadijima razvoja života, prisutnost intenzivnog UV zračenja, uključujući kratkovalno zračenje (zbog nepostojanja atmosferskih ekrana), dovela je do razvoja snažnih unutarstaničnih sustava koji popravljaju UV oštećenja, koja su u sadašnjim uvjetima suvišna za većina stanica višestaničnih životinja. Pri dovoljno niskom intenzitetu zračenja procesi popravljanja u stanici uspijevaju eliminirati nastala oštećenja prije nego njihov broj prijeđe određenu “kritičnu” vrijednost, što dovodi do pojave nepopravljivih oštećenja. Stanični sustavi uspijevaju dovršiti popravak genoma u vremenu koje se mjeri u nekoliko sati, ali za pojedinačna, najaktivnija mjesta DNA popravak dimera timina događa se mnogo brže. Vrijeme tijekom kojeg vanjski utjecaji mogu promijeniti integralni odgovor stanice na pulsno štetno djelovanje povezano je s procesima popravka. Za keratinocite kože oštećene UV zračenjem to vrijeme (sudeći prema rezultatima inhibitorne analize) iznosi nekoliko desetaka minuta. Štetni učinak može se smatrati "pulsnim" (pojedinačnim) ako je njegovo trajanje kraće od vremena tijekom kojeg se određuje sudbina oštećene stanice. Postoji razlog za vjerovanje da se za neke stanične reakcije na UV oštećenje to vrijeme mjeri u sekundama. Ako je, prema kriteriju MED, zakon zamjenjivosti intenziteta i vremena zračenja za UV eritem zadovoljen u rasponu od frakcija do stotina sekundi, tada eritem od doze koja prelazi MED raste s povećanjem intenziteta. To se kvantitativno izražava u činjenici da kada se intenzitet zračenja punim spektrom žarulje PRK-2 poveća za 3 reda veličine, nagib ovisnosti o dozi povećava se više od 3 puta.
Suvremena saznanja o staničnim mehanizmima omogućuju nam ustvrditi da, osim popravljanja stanice, postoji još jedna varijanta fiziološkog odgovora stanice na oštećenje - apoptoza, koja sprječava "patološku" staničnu smrt mehanizmom nekroze. Program eliminacije stanica mehanizmom apoptoze aktivira se kada je potpuni popravak nemoguć. Oštećenje ne bi trebalo premašiti prag na kojem se program apoptoze prekida. U potonjem slučaju dolazi do smrti stanice kroz mehanizam nekroze uz stvaranje upalne reakcije. Za UV zračenje, apsorbirana doza tradicionalno se mjeri kao energija koja pada na jedinicu površine ozračenog objekta, odnosno površinska gustoća doze. To je moguće jer biološki najaktivniji dio UV zračenja apsorbiraju površinski slojevi kože. U intervalu između doza oštećenja koje dovode stanicu do “čiste” apoptoze ili do nekroze, moguće je (pri dozi UVB zračenja od oko 350 J/m2) provesti program apoptoze s “promijenjenom morfologijom” ili “pro -inflamatorna apoptoza”, koja se javlja kada je program apoptoze modificiran, vjerojatno istim štetnim utjecajem koji je uzrokovao apoptozu. Eksperimentalno, proupalna apoptoza otkrivena je u (Caricchio R.e.a., J Immunol. prosinac 2003.). Bimodalnost djelovanja UV zračenja na keratinocite (nemonotona dozna ovisnost apoptoze) prikazana je i u drugim radovima. Ali priroda ovih pojava nije utvrđena. Čini se da je najvjerojatniji model da je ishod UV zračenja keratinocita kože određen brojem (udjelima) UV oštećenih mitohondrija. Ove pretpostavke potvrđuju osobitosti kinetike dvokomponentnog UVB eritema kože ovisne o dozi. Eksperimenti na uzgojenim ljudskim keratinocitima pokazuju da UVC zračenje proizvodi značajno veću količinu fotoproizvoda (CPD i (6-4)PP), a približno jednak apoptogeni učinak UVC i UVB zračenja posljedica je činjenice da UVB zračenje aktivira ne samo mitohondrije. , ali i put aktivacije apoptoze ovisan o kaspazi-8 (Takasawa R.e.a., PubMed - u procesu listopad 2005.). Najvažniji zadatak je proučavanje povezanosti UV-inducirane apoptoze i eritemogeneze, ali treba uzeti u obzir osobitosti apsorpcije UV-zračenja u različitim slojevima kože. Uspostavljanje veze između UV-inducirane apoptoze i eritemogeneze omogućit će nam razvoj neinvazivne metode za dijagnosticiranje parametara apoptotičkog sustava. Trenutno posebnu pozornost treba posvetiti razvoju dijagnostičkih metoda temeljenih na analizi reakcija tjelesnih sustava koji se razvijaju tijekom vremena na bilo koji (vanjski) utjecaj. Dijagnostičku metodu koja se razvija karakterizira niska cijena, neinvazivnost, apsolutna sterilnost i sposobnost pružanja fiziološkog, strogo doziranog ispitnog učinka na kožu i druge integumente.
Bibliografska poveznica
Bondyrev Yu.A. ANALIZA MOGUĆNOSTI KORIŠTENJA UV ZRAČENJA KAO ISPITIVANJA DIJAGNOSTIČKOG UTJECAJA // Suvremena pitanja znanosti i obrazovanja. – 2006. – br. 2.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=183 (datum pristupa: 05.01.2020.). Predstavljamo vam časopise izdavačke kuće "Akademija prirodnih znanosti"
Uređaji za snimanje optičkih spektara izgrađeni su prema jednom principu. Kao izvor UV zračenja obično se koristi "vodikova lampa" (električno pražnjenje u atmosferi vodika pri niskom tlaku), koja proizvodi gotovo kontinuirani emisijski spektar u području od 190-360 nm.
Raditi u vidljivo područje Koristi se žarulja sa žarnom niti s volframovom niti. Zračenje iz izvora ulazi u monokromator koji se sastoji od zrcala, kvarcne prizme i proreza. Reflektirajući se od zrcala, svjetlost se razlaže prizmom ili difrakcijskom rešetkom, a zatim se pomoću proreza izdvaja usko područje iz spektra. Kada se prizma okreće, spektar se pomiče u odnosu na prorez, što omogućuje dobivanje svjetlosnih zraka sa strogo definiranom valnom duljinom, obično s točnošću od ±0,5 nm. Monokromatsko zračenje prolazi kroz kvarcnu kivetu koja sadrži otopinu ispitivane tvari u otapalu prozirnom za UV područje. Debljina kiveta je 1-10 cm, najčešće su kivete presjeka 1´1 cm, a za njihovo punjenje potrebno je oko 3 ml otopine. Intenzitet svjetlosti koja prolazi kroz ćeliju mjeri se pomoću fotoćelije čija je trenutna vrijednost proporcionalna jačini upadne svjetlosti. Struja se pojačava i bilježi potenciometrom.
Intenzitet svjetlosnog snopa koji prolazi kroz ispitnu otopinu uspoređuje se s intenzitetom snopa koji prolazi kroz sličnu kivetu s čistim otapalom. Rezultirajuća razlika odgovara apsorpciji otopljene ispitivane tvari.
Ova se usporedba može napraviti na dva načina. Ako postoji jedan snop svjetlosti, na njegovu se putanju naizmjenično postavljaju kiveta s ispitivanom otopinom i otapalom (kiveta za usporedbu). Spektar se gradi točku po točku, postupno ručno podešavajući uređaj na određene valne duljine. U modernim instrumentima za snimanje, svjetlosni tok se dijeli na dvije identične zrake, od kojih jedna prolazi kroz otopinu koja se proučava, a druga kroz otapalo, a usporedba intenziteta svjetlosnih tokova koji prolaze kroz kivete i kontinuiranog promjena valnih duljina vrši se automatski. U oba slučaja dobiva se spektar tvari koji je ovisnost optičke gustoće otopine (D) o valnoj duljini apsorbirane svjetlosti:
U maksimalnim točkama, koeficijent molarne ekstinkcije izračunava se pomoću formule
Spektar je u većini slučajeva krivulja s jednim ravnim maksimumom. Velika širina apsorpcijske trake posljedica je činjenice da osim glavnih razina elektroničkih prijelaza, postoje podrazine povezane s vibracijama molekule. Veliki broj takvih podrazina obično dovodi do činjenice da se pojedinačni maksimumi koji im odgovaraju spajaju u jedan, koji ima ravni oblik. U nekim slučajevima, na primjer za aromatske spojeve, zbog vibracijskih podrazina, maksimum apsorpcije je skup uske pruge s obje strane glavnoga. U takvim slučajevima uobičajeno je reći da maksimum ima finu strukturu.
Instrumenti različitih izvedbi omogućuju dobivanje spektra u različitim spektralnim područjima. U UV području apsorbiraju se sve organske tvari. Valne duljine manje od 190 nm (daleko ili vakuumsko područje UV spektra) nisu prikladne za rad, budući da se u tom području apsorbiraju komponente zraka - kisik i dušik. Instrumenti za istraživanje u području valnih duljina 120-190 nm s vakuumskim komorama postoje, ali su složeni i rijetko se koriste u rutinskoj laboratorijskoj praksi; Postoje sheme u kojima se utjecaj zračnih plinova eliminira pročišćavanjem šupljina kroz koje prolazi zraka neupijajućim plinom.
Za valove dulje od 200 nm zrak je proziran, što čini blisko ultraljubičasto i vidljivo područje spektra (190-800 nm) pogodnim za mjerenje. U istom rasponu proziran je kvarc koji se koristi u UV spektroskopiji kao optički materijal za izradu prizmi i kiveta. Instrumenti za dobivanje apsorpcijskih spektara u ovom području su jednostavni i pristupačni. Količine tvari potrebne za studiju su male - oko 0,1 mg. U tom smislu, UV spektroskopija je trenutno jedna od najčešćih fizikalne i kemijske metode istraživanje organskih spojeva.
Apsorpcija organske tvari elektromagnetske vibracije u ultraljubičastom (UV) i vidljivom području uzrokovane su prijelazom elektrona iz veznih orbitala u antivezne ili nevezujuće orbitale; Ovo stanje molekule naziva se pobuđeno.
U interakciji s kvantom svjetlosti, elektron, apsorbirajući energiju, može se kretati od najviše ispunjene orbitale do najniže prazne orbitale. Elektrone prilično čvrsto drži jezgra, tako da su potrebne visoke energije za njihovo pobuđivanje i, stoga, elektromagnetsko zračenje, s kratkim valnim duljinama (120 - 800 nm).
Elektroni u atomima i molekulama zauzimaju orbitale sa strogo određenim energijama. Energetska razina atomskih orbitala određena je odgovarajućim skupom kvantnih brojeva. Molekularne orbitale mogu se zamisliti kao linearne kombinacije atomskih. Ova kombinacija daje veznu orbitalu ( ¯ , elektroni s antiparalelnim spinovima, normalno stanje) i antivezna orbitala ( , elektroni s paralelnim spinovima, pobuđeno stanje).
Obične organske molekule sadrže elektrone s- I str-veze, kao i elektroni usamljenih parova heteroatoma, odn n -elektroni. Njihove relativne energetske razine i usporedne energije mogućih prijelaza u pobuđeno stanje prikazane su na sl. 4, iz čega proizlazi da je za provedbu prijelaza potrebna najveća kvantna energija s®s*, tj. za pobuđivanje elektrona najtrajniji s-za komunikaciju su potrebni kvanti svjetlosti minimalne valne duljine. Energija prijelaza n®s* I p®p* manja, pa je stoga valna duljina svjetlosti koja pobuđuje takav prijelaz odgovarajuće veća. energija n -razina elektrona veća energija str-razine, pa pobudu uzrokuju kvanti svjetlosti još veće valne duljine. Praktični značaj imaju prijelaze n®p* I p®p*, budući da samo one odgovaraju valnim duljinama koje su unutar radnog raspona uređaja. Izuzetak su prijelazi p®p* izolirane dvostruke veze C=C I C=N, kao i trostruke veze i (l max 160-180 nm). Za izolirane višestruke veze samo se prijelaz karbonilne skupine pojavljuje u rasponu koji se koristi za mjerenja C=O(l max » 270 nm).
Skupine koje uzrokuju selektivnu apsorpciju elektromagnetska oscilacija u UV području nazivaju se kromofore . Glavni kromofori koji daju maksimum apsorpcije u području od 200-800 nm su sustavi konjugiranih dvostrukih veza. Orbitale koje čine dvije konjugirane dvostruke veze prikazane su na sl. 5.
Sa slike je očito da kada dvoje međusobno djeluju str- orbitale koje odgovaraju izoliranim dvostrukim vezama, nastaju dvije nove orbitale: vezna ( p+p) i labavljenje ( p-p). Pobuđeno stanje također odgovara dvjema orbitalama. Posljedično, za pobuđivanje elektrona konjugiranog sustava, tj. izvršiti prijelaz s najviše ispunjene ( p-p) za najniže upražnjeno radno mjesto ( p*+p*) orbitala, potrebno je manje energije nego za pobuđivanje elektrona izoliranih dvostrukih veza ( p®p*), tako da će konjugirane dvostruke veze apsorbirati kvante svjetlosti veće valne duljine od izoliranih dvostrukih veza. Kako se broj konjugiranih dvostrukih veza povećava, energija potrebna za pobuđivanje elektrona će se smanjivati, a apsorpcija svjetlosti će se opažati na većim valnim duljinama.
Intenzitet apsorpcije u spektru povezan je s vjerojatnošću dane vrste elektroničkog prijelaza. Međutim, ne provode se svi prijelazi koji se formalno čine mogućima u stvarnosti. Postoje takozvana pravila odabira koja određuju dopuštene i zabranjene prijelaze. Ova pravila uzimaju u obzir uglavnom simetriju molekule, kao i elektronsku simetriju osnovnog i pobuđenog stanja; Prijelazi u kojima se mijenja spin elektrona su zabranjeni. Intenzitet apsorpcije koji odgovara dopuštenim prijelazima obično je visok, koeficijent molarne ekstinkcije doseže tisuće, a ponekad i stotine tisuća jedinica, dok je za zabranjene prijelaze vrijednost e iznosi desetke, rjeđe stotine jedinica.
Razna područja spektar pruža različite informacije. UV spektri daju važne informacije o prisutnosti višestrukih i konjugiranih veza, IR spektri omogućuju promatranje brojnih manifestacija različitih molekularnih skupina, NMR i EPR spektri omogućuju proučavanje finih detalja mehanizama interakcija u reakcijama. Stoga je uvijek važno koristiti različite spektralne metode u kombinaciji.
Proučavanje UV spektra
Elektroničke razine opisane su jasno i s visokom točnošću u smislu teorije molekularnih orbitala. Na temelju detalja međudjelovanja i podataka o ionizacijskim potencijalima, moguće je rasporediti elektrone različitih molekularnih orbitala u sljedeće serije prema njihovoj energiji: s
Prisutnost i intenzitet linije u spektru određeni su vjerojatnošću ili rezolucijom odgovarajućeg prijelaza. Za opisivanje spektara koriste se sljedeća pravila:
a) apsorpciju jednog kvanta prati ekscitacija jednog elektrona;
b) ukupni broj okretaja tijekom elektroničkog prijelaza trebao bi ostati nepromijenjen.
Postoje pravila koja uzimaju u obzir simetriju molekule i simetriju osnovnog i pobuđenog stanja, ali nisu toliko univerzalna. U svim stabilnim molekulama, elektroni su uvijek upareni; ekscitacija prenosi elektron na višu energetsku razinu, ali njegov spin ostaje suprotan spinu preostalog elektrona. Sustavi koji sadrže samo sparene elektrone nazivaju se singlet ; sustavi u kojima su prisutni nespareni elektroni - trojka . Prijelazi između singlet ili triplet razina su dopušteni i manifestacije u spektrima su intenzivne (triplet razine su slabo naseljene i odgovarajuće linije su zbog toga slabe), prijelazi između singlet i triplet razina, naprotiv, zabranjeni su i linije koje odgovaraju oni su niskog intenziteta.
U molekulama je moguće razlikovati strukturne fragmente koji uzrokuju selektivnu apsorpciju zračenja i nazivaju se kromofori i fragmente koji stupaju u elektroničku interakciju s kromofore , čime se mijenja intenzitet apsorpcije i/ili položaj maksimuma i nazivaju se auksokromi . Razlikuju se sljedeće vrste utjecaja auksokroma:
A) batokromni pomak - pomak apsorpcijskog pojasa prema dužim valovima (nižim frekvencijama) ili crveni pomak;
b) gipsokromni shift - pomak prema kraćim valovima (više frekvencije) ili plavi pomak;
V) hiperkromna učinak - povećanje intenziteta apsorpcije;
G) hipokromna učinak - smanjenje intenziteta apsorpcije
UV spektar organske tvari je karakterističan, budući da apsorpciju određuju samo sam kromofor i njegova neposredna okolina, tj. isti se kromofor gotovo jednako očituje i u relativno jednostavnim i u najsloženijim molekulama. Ovisno o neposrednom okruženju iste skupine kromofora, položaj apsorpcijskog maksimuma u UV spektrima različitih spojeva može malo varirati. Pomak maksimuma prema duljim valovima obično se naziva batokromni pomak, a pomak prema kraćim valovima naziva se hipsokromni. Zamjena otapala u nekim slučajevima može uzrokovati promjene u položaju vrpci (za 2-10 nm) i njihovom intenzitetu (za 10-20%).
U pravilu, takva zamjena utječe na spektre polarnih tvari i nema praktički nikakav učinak na UV spektre nepolarnih spojeva. Najdramatičnije promjene u spektrima posljedica su kemijske interakcije tvari s otapalom (osobito stvaranja vodikove veze), kao i promjene u stupnju disocijacije ili omjeru tautomernih oblika tvar. U svim takvim slučajevima potrebno je provjeriti je li za dano rješenje zadovoljen Bouguer-Lambert-Beerov zakon.
Stoga UV spektroskopija omogućuje određivanje kromofornih skupina u spojevima koji se proučavaju i pruža izvrsnu priliku za kvantitativnu analizu tvari koje sadrže takve skupine. Kao strukturna analitička metoda, UV spektroskopija je znatno manje informativna u usporedbi s drugim metodama i uglavnom je empirijske prirode, budući da odnos između prirode apsorpcije i strukture molekule nema striktno fizičko i matematičko opravdanje, što, međutim, , ne sprječava široku upotrebu metode.
Odsutnost maksimuma apsorpcije u području od 200-800 nm u UV spektru tvari koja se proučava služi kao pouzdan dokaz da ova tvar ne sadrži konjugirane dienske ili polienske sustave, aromatske jezgre i karbonilne skupine. Ova je značajka često korisna u određivanju strukture spoja, na primjer, olakšavajući razlikovanje između izomera s konjugiranim i izoliranim dvostrukim vezama, kao u slučaju donjeg para:
UV spektri glavnih heterocikličkih spojeva prikazani su u nastavku:
Dakle, prednosti metode su prilično očite (dokaz o prisutnosti u tvari od interesa skupina-kromofora konjugiranog diena, poliena i aromatskih sustava, kao i karbonilne skupine ili njihove odsutnosti; u najjednostavnijim slučajevima, sposobnost odrediti vrstu kromofora, duljinu konjugacijskog lanca, broj alkilnih skupina na kromoforu, uključujući registraciju promjena u koncentracijama otopine tijekom vremena) i ograničenja metode (ograničeno područje primjene, budući da mnogi vrste organskih spojeva nemaju apsorpcijski maksimum u području koje se proučava; relativno male mogućnosti rješavanja strukturnih analitičkih problema, u nekim slučajevima, jak utjecaj prirode otapala na prirodu spektra; Bouguer-Lambert-Beerov zakon; fotokemijska izomerizacija tvari tijekom rada (na primjer, cis-trans izomerizacija u dienskim i polienskim sustavima).
Fotometrijske (apsorpcijske) metode analize temelje se na sposobnosti analizirane tvari da selektivno apsorbira svjetlost.
Analiza tvari na temelju mjerenja apsorpcije svjetla uključuje spektrofotometriju i fotokolorimetriju.
Spektrofotometrija se temelji na apsorpciji monokromatske svjetlosti, tj. svjetlosti određene valne duljine (1-2 nm) u vidljivom, ultraljubičastom i infracrvenom području spektra.
Ovakvo mjerenje apsorpcije svjetlosti provodi se pomoću spektrofotometara različitih marki, koji uvijek koriste monokromatski tok svjetlosne energije dobiven kroz optički sustav koji se naziva monokromator.
Apsorpcija u ultraljubičastom (UV) i vidljivom području spektra uglavnom je posljedica pobude elektrona.
Apsorpcija svjetlosti u infracrvenom području spektra (IR) uzrokovana je molekularnim vibracijama.
Ovisno o rasponu valnih duljina na kojima se mjeri apsorpcija svjetlosti otopina kemijskih tvari, metode koje se temelje na mjerenju apsorpcije svjetlosti dijele se na spektrofotometriju u UV području spektra s područjem valnih duljina 200-400 nm, spektrofotometriju u vidljivom dijelu spektra. spektralno područje (400-760 nm) i spektrofotometrija u infracrvenom području spektra (760-20 000 nm). Ali obično je mjerna jedinica za valne duljine IR spektra mikron (1 μ = 10 -4 cm) ili valni broj (cm -1), tj. broj valova u 1 cm.
U farmaceutskoj analizi češće se koristi spektroskopija u UV vidljivom području spektra.
Metoda UV spektroskopije uključena je u GF IX, GF X i MF II, kao iu najnovija izdanja farmakopeje gotovo svih zemalja za određivanje identiteta, čistoće i kvantifikacije tvari u pripravcima.
Apsorpcijski spektar ili apsorpcijski spektar je grafički prikaz količine svjetlosti koju apsorbira tvar na određenim valnim duljinama.
Za konstruiranje karakteristične krivulje apsorpcije, vrijednosti valne duljine (R) za UV spektroskopiju ili valni brojevi (cm -1) za IR spektroskopiju iscrtavaju se na apscisnoj osi, a vrijednost ekstinkcije (L) 1 ili postotak propusnosti (G) ( s IR spektroskopijom) - na ordinatnoj osi (sl. 5, 6).
Pri izradi krivulja spektra ekstinkcije u UV i vidljivom dijelu spektra, možete koristiti vrijednosti specifičnih indikatora ekstinkcije (J 1% i CM) ili molarni indeks apsorpcije (e) 2, gdje je e optička gustoća 1 M otopine tvari u sloju debljine 1 cm; J 1% i CM je vrijednost ekstinkcije otopine koja sadrži 1 g tvari u 100 ml otopine s debljinom sloja od 1 cm.
Ove vrijednosti se određuju eksperimentalno, a za mnoge tvari dane su u literaturi.
Karakteristika apsorpcijskog spektra je položaj maksimuma (minimuma) apsorpcije svjetlosti od strane tvari, kao i intenzitet apsorpcije, koji je karakteriziran optičkom gustoćom. (D) ili specifična stopa apsorpcije (J 1% 1cm) na određenim valnim duljinama.
UV spektrofotometrijska mjerenja obično se provode u otopinama. Kao otapala koriste se destilirani ugljikovodici.
voda za kupanje, kiseline, lužine, alkoholi (etil, metil) i neka druga organska otapala.
Otapalo ne bi trebalo apsorbirati svjetlost u istom području spektra kao tvar koja se proučava. Priroda spektra može se promijeniti u različitim otapalima, kao i kada se promijeni pH vrijednost medija.
Čimbenici koji određuju apsorpciju svjetlosti od strane tvari koje se proučavaju su prisutnost u njihovim molekulama tzv.
Svaka funkcionalna skupina u molekuli tvari karakterizirana je apsorpcijom svjetlosti u određenom području spektra, što se koristi za potrebe identifikacije i kvantitativnog određivanja tvari u pripravku.
Osim kromofora, molekula može sadržavati funkcionalne skupine koje same ne apsorbiraju ultraljubičasto svjetlo, ali mogu utjecati na ponašanje kromofora povezanog s njima. Takve skupine, zvane auksokromi, obično uzrokuju pojavu apsorpcije na duljim valnim duljinama i s višim koeficijentom ekstinkcije nego što je tipično za određeni kromofor. Primjeri auksokroma: -SH, -NH 2, -OH.
IR spektre većine organskih spojeva, za razliku od UV spektra, karakterizira prisutnost većeg broja apsorpcijskih vrhova (vidi sliku 6). Stoga metoda PC spektroskopije omogućuje dobivanje najcjelovitijih informacija o strukturi i sastavu analizirane tvari, omogućujući identifikaciju spojeva koji su strukturno vrlo slični.
U GF X i MF II metoda IR spektroskopije koristi se za identifikaciju mnogih organskih ljekovitih tvari s polifunkcionalnim skupinama u njihovim molekulama usporedbom sa spektrima standardnih uzoraka uzetih pod istim uvjetima. U izvornoj literaturi posljednjih godina daju se! IR spektri antibiotika, hormona, kumarina i mnogih drugih ljekovitih tvari organske prirode. U vezi sa sve većim zahtjevima za kvalitetom lijekova, IC spektroskopija kao jedna od pouzdanih metoda identifikacije postaje sve važnija.
Dvije druge vrste spektroskopije koje se često koriste u organskoj kemiji su ultraljubičasta (UV) spektroskopija i masena spektrometrija (MS). U ovoj se knjizi nećemo detaljnije zadržavati na njima i nećemo se baviti tumačenjem spektara, već ćemo se ograničiti samo na upoznavanje s osnovnim principima i prirodom informacija koje te vrste spektroskopije daju.
Ultraljubičasta (UV) spektroskopija proučava apsorpciju svjetlosti organskih tvari u ultraljubičastom području spektra (valna duljina od 200 do 400 nm). Zračenje ove valne duljine apsorbiraju samo spojevi koji sadrže -veze (na primjer, skupine ili Apsorpcija je uzrokovana elektronskim prijelazima unutar molekule. Za molekule koje imaju -veze, energetska razlika između osnovnog i pobuđenog elektronskog stanja odgovara energiji fotona UV zračenje uzrokuje prijelaz elektrona u molekularnu orbitalu više energije.
UV spektar obično se sastoji od jedne široke apsorpcijske trake, čiji položaj označava okolinu dvostruke veze u molekuli. Što je veći broj dvostrukih veza u molekuli koja tvori konjugacijski lanac, veća je valna duljina apsorbirane svjetlosti. Izraz konjugacija znači da su dvije dvostruke veze odvojene jednom jednostrukom vezom. U tablici Slika 114 prikazuje položaj apsorpcijskih maksimuma nekih tipičnih struktura. Na sl. 11-22 prikazuje UV spektar α-cikloheksadiena.
Sa stola 11-4 pokazuje da pojava nove dvostruke veze u konjugacijskom lancu povećava valnu duljinu apsorbiranog UV zračenja za približno
Riža. 11-22 (prikaz, ostalo). UV spektar 1,3-cikloheksadiena
Tablica 11-4. (vidi sken) Položaj maksimuma UV apsorpcije za neke spojeve
na 30-50 nm. Imajte na umu i da tvari koje nemaju dvostruke veze ne apsorbiraju UV zračenje.
Ako molekula ima konjugacijski lanac koji se sastoji od sedam ili više dvostrukih veza, tada takva tvar apsorbira vidljivu svjetlost (valna duljina 400-700 nm) i obojena je zbog selektivne apsorpcije određenih boja.
Ultraljubičasta spektroskopija omogućuje određivanje broja konjugiranih dvostrukih veza ugljik-ugljik i ugljik-kisik u molekuli. Apsorpcija se događa zbog elektronskih prijelaza.
Zbog jednostavnosti analitičkih operacija i, u većini slučajeva, visoke osjetljivosti, metoda je našla široku primjenu u farmaceutskoj analizi.
UV spektrofotometrijom se utvrđuje autentičnost (identifikacija), kakvoća i kvantitativno određivanje kako pojedinačnih tvari tako i sastojaka oblika lijeka; ispitivanje prema testovima „Otvaranja” i „Ujednačenosti doziranja”.
Metoda se koristi u takvim fazama proučavanja ljekovitih tvari i oblika doziranja kao što su farmakokinetika, bioraspoloživost, proučavanje stabilnosti i određivanje roka trajanja.
Ispitivanje autentičnosti ljekovitih supstanci. Ova faza farmaceutske analize temelji se na sljedećim tehnikama:
a) pronalaženje λ max i λ min u spektru, karakterizirajući područja maksimalne i minimalne apsorpcije;
b) izračunavanje omjera optičkih gustoća otopine koja se proučava na različitim valnim duljinama;
c) karakteristike intenziteta apsorpcije na temelju specifičnog indeksa (E);
d) usporedba spektra analita sa spektrom standardnog uzorka iste tvari.
U svim slučajevima potrebno je dobiti spektar pod uvjetima navedenim u ND - otapalo, koncentracija, raspon valnih duljina, veličina (debljina) kivete.
Za slučaj (a), λ max i λ min nalaze se u rezultirajućem spektru i uspoređuju s istim karakteristikama danim u ND - ako su tvari identične, obje se vrijednosti moraju podudarati (tablica 7).
Prikladna tehnika za testiranje autentičnosti je određivanje omjera apsorpcijskih vrijednosti na dva maksimuma. Time se smanjuje utjecaj varijabli instrumenta na test i eliminira potreba za korištenjem standardnog uzorka. Ova metoda se koristi u slučaju analize natrijevog para-aminosalicilata
Tablica 7
Karakteristike UV spektra koji se koriste u identifikaciji određenih ljekovitih tvari u farmakopejskoj analizi
|
№ p/p |
Ljekovita tvar |
Koncentracija i otapalo |
Obilježje koje se koristi za identifikaciju |
|
Amlodipin besilat |
0,005% u 1% otopini 0,1 M HCl u metanolu |
λ max = 360 ± 2 nm; E= 113-121 |
|
|
Aminazin |
0,0005% u 0,01 M HCl |
λ max = 254±2nm, 307±2nm |
|
|
Anestezin |
0,0005% u 0,1 M NaOH |
λ max = 281±2nm; λ min = 238±2nm |
|
|
Verapamil hidroklorid |
0,002% u 0,01 M HCl |
D 229 = 0,61 – 0,64 D 278 = 0,23 – 0,24 |
|
|
deksametazon |
0,001% u 95% alkoholu |
λ max = 240±2nm; D 240 nm / D 263 nm = 1,9 – 2,1 |
|
|
0,002% u 95% alkoholu |
λ max =244±2nm, 275±2nm, 281±2nm; λ min =230±2nm, 259±2nm, 279±2nm; prikazana je slika spektra |
||
|
Difenhidramin |
0,05% u 95% alkoholu |
λ max =253±2nm, 258±2nm, 264±2nm; λ min =244±2nm, 255±2nm, 263±2nm |
|
|
Drotaverin hidroklorid |
0,0015% u 0,1 M HCl |
λ max =241±2nm,302±2nm,353±2nm; λ min =223±2nm,262±2nm,322±2nm |
|
|
Zopiklon |
0,001% u 0,1 M HCl |
λ max =303±2nm; D 303 = 0,340-0,380 |
|
|
0,0006% otopina kamfor 2,4-dinitrofenilhidrazona u 95% etil alkoholu |
λ max = 231±2nm, 265±2nm; rame u području od 273 nm do 277 nm |
||
|
Askorbinska kiselina |
0,001% u pufer otopini s pH 7,0 |
λ max =265±2nm |
|
|
nikotinska kiselina |
0,002% u 0,1 M NaOH |
λ max =258±2nm, 264±2nm, 270±2nm; λ min =240±2nm; u području od 240 nm do 256 nm uočena su dva neidentificirana ramena |
|
|
Folna kiselina |
0,001% u 0,1 M NaOH |
Potpuna podudarnost sa GSO spektrom u području od 230 do 380 nm |
|
|
nitroksolin |
0,0005% otopina u mješavini 95% alkohola - pufer otopina s pH 9,18 (98:2) |
λ max =249±2nm, 341±2nm, dva ramena u području od 228nm do 238nm i od 258nm do 268nm |
|
|
ofloksacin |
0,001% u 0,1 M HCl |
λ max = 226±2nm, 295±2nm; λ min = 265±2nm |
|
|
Papaverin hidroklorid |
0,0025% u 0,01 M HCl |
λ max = 285±3nm, 309±2nm; λ min = 289±2nm |
|
|
Piracetam |
1% vodena otopina |
Nema izražene maksimume apsorpcije u području od 230 nm do 350 nm |
|
|
progesteron |
0,001% u 95% alkoholu |
λ max = 241±2nm; E= 518-545 |
|
|
Ranitidin hidroklorid |
0,01% vodena otopina |
λ max = 229±2nm; 315±2nm; D 229 nm / D 315 nm = 1,01 – 1,07 |
|
|
Sulfa-dimetoksin |
0,000015% u NaOH 0,000015% u HCl |
Spektar alkalne otopine lijeka, uzet u odnosu na kiselu otopinu, ima λ max = 253 ± 2 nm, 268 ± 2 nm; λ min = 260±2nm; Spektar kisele otopine lijeka, uzet u odnosu na alkalnu otopinu, ima λ max = 288 ± 2 nm |
|
|
Tamoksifen citrat |
0,002% u metanolu |
λ max =237nm, 275nm |
|
|
famotidin |
0,0025% u fosfatnom puferu |
Potpuna podudarnost sa RSO spektrom u području od 230 nm do 350 nm |
|
|
Furazolidon |
0,0015% u DMF-u |
λ max =260±2nm, 367±2nm; λ min =302±2nm |
|
|
Furacilin |
0,0006% u DMF-u |
λ max =260±2nm, 375±2nm; λ min =306±2nm |
Prilikom testiranja autentičnosti često se preporuča izračunati maksimum apsorpcije E (na primjer, za kloramfenikol, adrenalin, progesteron) ili usporediti pronađenu vrijednost optičke gustoće u određenom rasponu valnih duljina s vrijednostima navedenim u ND. Tako apsorpcijski spektar otopine piridoksin hidroklorida u otopini fosfatnog pufera (pH = 6,9) koncentracije 0,5 mg/ml u području od 230 do 250 nm ima maksimume na 254 i 324 nm, a optička gustoća na ovi maksimumi su jednaki 0, odnosno 0,35.
Neki testovi autentičnosti pomoću UV spektrofotometrije zahtijevaju upotrebu referentnih materijala (RM) ljekovitih tvari. U tom slučaju, uzorak CO mora biti pripremljen i istovremeno određen pod istim uvjetima kao ispitivana tvar. Dakle, UV spektar 0,0005% otopine etinitestradiola u etilnom alkoholu trebao bi imati maksimume i minimume na istim valnim duljinama kao otopina CO iste koncentracije, odgovarajuće vrijednosti apsorpcije izračunate za suhu tvar na λ max = 281 nm trebale bi biti ne razlikuju više od 3%. Ova tehnika daje pouzdanije rezultate nego kada se analizira spektar samo jednog ispitivanog spoja.
UV spektrofotometrija također je jedna od komponenti kompleksa spektralnih metoda za proučavanje novih biološki aktivnih tvari. Određene apsorpcijske trake u spektru mogu ukazivati na prisutnost u strukturi ovog spoja određenih funkcionalnih skupina, fragmenata struktura (kromofora). Ovo objašnjava sličnost spektara tvari koje sadrže fenilni radikal, na primjer, efedrin, difenhidramin, atropin, benzilpenicilin. Imaju tri maksimuma apsorpcije: 251, 257 i 263 nm (slika 7).
Ljekovite tvari koje sadrže supstituirani aromatski radikal - adrenalin, morfin, estradiol, kloramfenikol i dr. - imaju jedan maksimum u spektru od oko 260 nm, konjugirani enonski sustav u lijekovima iz skupine kortikosteroida je oko 238 nm (slika 8. ).
Za neke ljekovite tvari (derivati barbiturne kiseline, sulfonamidi, fenoli, neki derivati purina itd.) priroda spektra može se mijenjati ovisno o pH otopine (sl. 9, 10, 11, 12, 14). U tom se slučaju mijenja λ max (batokromni pomak), povećava se apsorpcija (povećava se optička gustoća) i opaža se hiperkromni učinak. Kofein ne pokazuje kisela svojstva, pa je njegov apsorpcijski maksimum u kiseloj i alkalnoj sredini na istoj valnoj duljini - 272 nm (slika 13). To jest, UV spektrofotometrija može pružiti informacije o određenim svojstvima tvari koja se proučava.
UV spektrofotometrijom nemoguće je donijeti jednoznačan zaključak o strukturi kemijskog spoja, jer je interpretacija spektra otežana zbog prisutnosti više od jednog kromofora u molekuli. Ipak, metoda omogućuje određivanje nekih skupina - kromofora i izvođenje zaključaka o prirodi i stupnju konjugacije (s produljenjem konjugacijskog lanca uočava se pomak apsorpcijskog maksimuma u područje veće valne duljine, sl. 11. ).
UV spektrofotometrijom se proučavaju svojstva organskih spojeva: sposobnost stvaranja vodikovih veza, određivanje pK a kiselina i baza, određivanje sastava i svojstava kompleksnih spojeva ljekovitih tvari, izomerija.
Cis i trans izomeri imaju različite spektre. Trans oblik obično jače apsorbira i njegov je apsorpcijski pojas pomaknut prema dužim valnim duljinama; ova činjenica može poslužiti kao dokaz promjene strukture tijekom reakcije.
Međutim, UV spektri ne daju nikakve informacije o strukturi tvari koja se proučava, jer omogućuju nam da ustanovimo samo prisutnost kromofora i heteroatoma.
Uz to, UV spektrofotometrija pruža izvrsnu priliku za kvantitativnu analizu tvari koje sadrže takve skupine.
Kada se testira na dobrotu (čistoću) koristiti iste karakteristike kao za identifikaciju. U prisutnosti nečistoća, λ max se može promijeniti, mogu se pojaviti dodatni maksimumi i može se promijeniti intenzitet apsorpcije.
Specifične nečistoće prisutne u ljekovitim tvarima u pravilu imaju sličnu kemijsku strukturu tvari koja se proučava. Stoga su od posebnog interesa slučajevi kada ljekovita tvar i njezina specifična nečistoća apsorbiraju na različitim valnim duljinama.
Na primjer, λ max adrenalina (Ι) nalazi se na 278 nm, a njegova specifična nečistoća, adrenolon (ΙΙ), ima apsorpcijski maksimum na 310 nm.
Prema zahtjevu farmakopejske monografije, u 0,05% otopini adrenalina pripremljenoj za ispitivanje čistoće, optička gustoća na 310 nm ne smije biti veća od 0,1 (tj. strogo regulirani sadržaj adrenalina dopušten je u adrenalinu).
Kvantifikacija. Princip kvantitativnog određivanja UV spektrofotometrijom je sljedeći: uzorak analiziranog uzorka (tvar, oblik lijeka i sl.) se otopi u odgovarajućem otapalu, po potrebi se pripremi dodatno razrjeđenje dobivene otopine i odredi se njegova optička gustoća. mjeri se na valnoj duljini navedenoj u metodi. Koncentracija (sadržaj) analita određuje se jednom od prethodno opisanih metoda (odjeljak 1.2.3.4).
Sukladno suvremenim zahtjevima za tablete, dražeje, suhe lijekove za injekcije i ljekovite tvari u kapsulama s udjelom djelatne tvari od 0,05 g ili manje potrebno je ispitivanje ujednačenosti doziranja, tj. sadržaj tvari u svakoj pojedinačnoj dozi. Za takvu procjenu, posebice u slučaju sadržaja djelatne tvari u mg ili njezinih frakcija (klonidin tablete sadrže 0,075 i 0,15 mg djelatne tvari), potrebna je uporaba visokoosjetljive metode. To je UV spektrofotometrija u većini slučajeva.
Relevantno je proučavanje bioraspoloživosti ljekovitih tvari. Njegova specifična karakteristika je test “Rastvaranje” (GF ΧΙ, br. 2, str. 154). UV spektrofotometrija, koja se obično odlikuje visokom osjetljivošću, jedna je od najčešće korištenih metoda u tu svrhu (tablica 8).
U nastavku su navedene metode za analizu nekih ljekovitih tvari spektrofotometrijskom metodom u UV području, au tablici 8 prikazan je niz primjera primjene UV spektrofotometrijske metode u farmakopejskoj analizi.