5.1. Struktura bakterijskog genoma
Nasljedne informacije pohranjene su u bakterijama u obliku niza nukleotida DNA, koji određuju slijed aminokiselina u proteinu (struktura DNA prikazana je u odjeljku 3.1 i prikazana na slici 3.1).
Svaki protein ima svoj gen, tj. diskretna regija na DNA koja se razlikuje po broju i specifičnosti nukleotidnog niza.
Skup svih gena bakterija naziva se genom. Veličina genoma određena je brojem parova nukleotidnih baza (bp). Bakterijski genom ima haploidni skup gena. Bakterijski genom sastoji se od genetskih elemenata sposobnih za neovisnu replikaciju (razmnožavanje), tj. replikoni. Replikoni su bakterijski kromosom i plazmidi.
5.1.1. Bakterijski kromosom
Bakterijski kromosom predstavlja jedna dvolančana molekula DNA. Dimenzije bakterijskog kromosoma u različitim predstavnicima domene Procaryotae varirati. Na primjer, na E. coli bakterijski kromosom sadrži 4,7x10 6 bp. Sadrži oko 4300 gena. Za usporedbu: veličina virusne DNA je oko 10 3 bp, kvasca - 10 7 bp, a ukupna duljina ljudske kromosomske DNA je 3x10 9 bp.
Bakterijski kromosom E. coli predstavljena 1 kružnom molekulom DNA. Brojne druge bakterije također imaju jedan prstenasti kromosom: Shigella spp., Salmonella spp., P. aeruginosa, B. subtilus. Međutim, ova struktura genoma nije univerzalna. U nekim bakterijama, posebice u V. cholerae, L. interrhogans, Brucella spp., imati
Postoje dva prstenasta kromosoma. Kod brojnih drugih bakterija (B. burgdorferi, Streptomyces spp.) Otkriveni su linearni kromosomi.
Bakterijski kromosom tvori kompaktni nukleoid bakterijske stanice. On kodira funkcije vitalne za bakterijsku stanicu.
5.1.2. Bakterijski plazmidi
Plazmidi su dvolančane molekule DNA veličine od 10 3 do 10 6 bp. Mogu biti prstenasti ili linearni. Plazmidi kodiraju funkcije koje nisu bitne za život bakterijske stanice, ali koje bakterijama daju prednosti kada su izložene nepovoljnim životnim uvjetima.
Među fenotipskim karakteristikama koje plazmidi daju bakterijskoj stanici su sljedeće:
Otpornost na antibiotike;
Proizvodnja faktora patogenosti;
Sposobnost sintetiziranja antibiotskih tvari;
Stvaranje kolicina;
Razgradnja složenih organskih tvari;
Stvaranje restrikcijskih i modifikacijskih enzima. Replikacija plazmida odvija se neovisno o kromosomu c
sudjelovanje istog skupa enzima koji provodi replikaciju bakterijskog kromosoma (vidi odjeljak 3.1.7 i sl. 3.5).
Neki plazmidi su pod strogom kontrolom. To znači da je njihova replikacija povezana s replikacijom kromosoma tako da svaka bakterijska stanica sadrži jednu ili barem nekoliko kopija plazmida.
Broj kopija plazmida pod slabom kontrolom može doseći od 10 do 200 po bakterijskoj stanici.
Da bi se opisali plazmidni replikoni, oni se obično dijele u skupine kompatibilnosti. Nekompatibilnost plazmida povezana je s nesposobnošću dvaju plazmida da stabilno opstanu u istoj bakterijskoj stanici. Nekompatibilnost je karakteristična za one plazmide koji imaju veliku sličnost replikona, čije je održavanje u stanici regulirano istim mehanizmom.
Plazmidi koji se mogu reverzibilno ugraditi u bakterijski kromosom i funkcioniraju kao jedan replikon nazivaju se integrativni ili epizomi.
Plazmidi koji se mogu prenositi iz jedne stanice u drugu, ponekad čak pripadaju drugoj taksonomskoj jedinici, nazivaju se prenosivi (konjugativni) Prijenosnost je svojstvena samo velikim plazmidima koji imaju tra-operon, koji kombinira gene odgovorne za prijenos plazmida. Ovi geni kodiraju spolne pilije, koje tvore most sa stanicom koja ne sadrži transmisivni plazmid, duž kojeg se plazmidna DNA prenosi u novu stanicu. Ovaj proces se zove konjugacija(detaljno će biti riječi u odjeljku 5.4.1). Bakterije koje nose transmisivne plazmide osjetljive su na "muške" filamentozne bakteriofage.
Mali plazmidi koji ne nose tra gene ne mogu se sami prenijeti, ali su sposobni za prijenos u prisutnosti prenosivih plazmida pomoću svog aparata za konjugaciju. Takvi se plazmidi nazivaju mobiliziran, i sam proces - mobilizacija neprenosivi plazmid.
Poseban značaj u medicinskoj mikrobiologiji imaju plazmidi koji daju otpornost bakterija na antibiotike, a koji se nazivaju R-plazmidi (od engl. otpornost - protudjelovanje), te plazmidi koji osiguravaju stvaranje faktora patogenosti koji pridonose razvoju infektivnog procesa u makroorganizmu. R-plazmidi sadrže gene koji određuju sintezu enzima koji uništavaju antibakterijske lijekove (na primjer, antibiotike). Kao rezultat prisutnosti takvog plazmida, bakterijska stanica postaje rezistentna (rezistentna) na djelovanje cijele skupine lijekova, a ponekad i na više lijekova. Mnogi R-plazmidi su prenosivi, šireći se kroz bakterijsku populaciju, čineći je nedostupnom učincima antibakterijskih lijekova. Bakterijski sojevi koji nose R-plazmide vrlo su često etiološki uzročnici nozokomijalnih infekcija.
Plazmidi koji određuju sintezu faktora patogenosti sada su pronađeni u mnogim bakterijama koje su uzročnici ljudskih zaraznih bolesti. Patogenost uzročnika šigeloza, jersinioza, kuga, antraks, iksodidne borelioze i intestinalne ešerihioze povezana je s prisutnošću i funkcioniranjem plazmida patogenosti.
Neke bakterijske stanice sadrže plazmide koji određuju sintezu baktericidnih sredstava protiv drugih bakterija.
jama tvari. Na primjer, neki E. coli posjeduju Col plazmid, koji određuje sintezu kolicina, koji imaju mikrobicidno djelovanje protiv koliformnih bakterija. Bakterijske stanice koje nose takve plazmide imaju prednosti u kolonizaciji ekoloških niša.
Plazmidi se koriste u praktičnim ljudskim aktivnostima, posebice u genetskom inženjeringu u konstrukciji posebnih rekombinantnih bakterijskih sojeva koji proizvode velike količine biološki aktivnih tvari (vidi Poglavlje 6).
5.1.3. Mobilni genetski elementi
Mobilni genetski elementi nalaze se u bakterijskom genomu iu bakterijskom kromosomu iu plazmidima. Mobilni genetski elementi uključuju insercijske sekvence i transpozone.
Umetnuti (umetanje) sekvence - IS elementi (od engl. sekvence umetanja)- to su dijelovi DNA koji se kao cjelina mogu kretati iz jednog dijela replikona u drugi, kao i između replikona. IS elementi su veličine 1000 bp. i sadrže samo one gene koji su nužni za vlastito kretanje – transpoziciju: gen koji kodira enzim transpozazu, koji osigurava proces isključivanja IS elementa iz DNK i njegovu integraciju u novi lokus, te gen koji određuje sintezu represor koji regulira cjelokupni proces kretanja. Ti su geni okruženi obrnuto ponavlja koji služe kao rekombinacijska mjesta koja prate kretanje insercijske sekvence uz sudjelovanje transpozicijskih enzima, posebice transpozaza.
Invertirana ponavljanja prepoznaje enzim transpozaza (Sl. 5.1), koji izvodi jednolančane prekide u DNK lancima koji se nalaze s obje strane prijenosnog elementa. Izvorna kopija IS elementa ostaje na istom mjestu, a njegov replicirani duplikat premješta se na novo mjesto.
Kretanje mobilnih genetskih elemenata obično se naziva replikativna ili nelegitimna rekombinacija. Međutim, za razliku od bakterijskog kromosoma i plazmida, mobilni genetski elementi nisu neovisni replikoni,
Riža. 5.1. Shema strukture IS elementa: 1 - represorski gen; 2 - gen za transpozazu; strelice označavaju mjesta ruptura
budući da je njihova replikacija sastavni element replikacije DNA replikona u kojem se nalaze.
IS elementi se razlikuju po veličini, vrsti i broju invertiranih ponavljanja.
Transpozoni - To su segmenti DNA koji imaju ista svojstva kao IS elementi, ali sadrže strukturne gene, tj. geni koji osiguravaju sintezu molekula koje imaju specifično biološko svojstvo, kao što je toksičnost, ili pružaju otpornost na antibiotike.
Kretanje mobilnih genetskih elemenata duž replikona ili između replikona uzrokuje:
Inaktivacija gena onih dijelova DNK gdje su oni, nakon premještanja, integrirani;
Formiranje oštećenja genetskog materijala;
Fuzija replikona, tj. integracija plazmida u kromosom;
Širenje gena u bakterijskoj populaciji, što može dovesti do promjena u biološkim svojstvima populacije, promjena u uzročnicima zaraznih bolesti, a također doprinosi evolucijskim procesima među mikrobima.
5.1.4. Integroni
Osim plazmida i mobilnih genetskih elemenata, bakterije imaju još jedan sustav koji potiče širenje gena - integronski sustav. Integroni su sustav za hvatanje malih DNK elemenata tzv genske kasete, putem rekombinacije specifične za mjesto i njihove ekspresije.
Integron se sastoji od očuvane regije smještene na 5" kraju, koja sadrži gen koji kodira enzim integrazu, mjesto rekombinacije att i promotor P (slika 5.2).
Kaseta može postojati u dva oblika: linearna, kada je kazeta integrirana u integron, i u obliku male kružne dvolančane DNA. Kazete su veličine od 260 do 1500 bp. Sadrže pretežno 1 gen za otpornost na antibiotike i mjesto rekombinacije koje se sastoji od 59 parova baza smještenih na 3" kraju.
Integraza provodi rekombinaciju između mjesta od 59 bp. kasete i zaplet att integron, ugrađujući kazetne gene u integron u takvoj orijentaciji da se mogu eksprimirati iz P integron promotora. Integracija kazeta u integron je reverzibilan proces. Integroni se mogu nalaziti i na kromosomu i na plazmidima. Stoga je moguće da se kazete kreću od jednog integrona do drugog, kako unutar jedne bakterijske stanice, tako i kroz cijelu bakterijsku populaciju. Jedan integron može uhvatiti više kazeta rezistencije na antibiotike. Promjene
Riža. 5.2. Integronska struktura: attI- mjesto rekombinacije integrona; intI- gen koji kodira integrazu; P - promotor; attC- mjesta rekombinacije kazeta otpornosti na antibiotike
Bakterijski genom, a time i svojstva bakterija, mogu nastati kao rezultat mutacija i rekombinacija.
5.1.5. Otoci patogenosti
U genomu patogene bakterije(vidi Poglavlje 8) postoje dijelovi DNA od najmanje 10 000 parova nukleotida koji se razlikuju od glavnog genoma u sastavu parova G-C nukleotidnih baza. Ta su područja odgovorna za sintezu faktora patogenosti koji osiguravaju razvoj patološkog procesa u tijelu domaćina, pa su stoga nazvana otoci patogenosti. Otoci patogenosti obično su okruženi izravnim ponavljanjem sekvenci DNA ili IS elemenata. Neki sadrže regije karakteristične za integracijska mjesta smještena u blizini tRNA gena. Većina otoka patogenosti lokalizirana je na bakterijskom kromosomu (salmonela), ali mogu biti i dio plazmida (Shigella) i DNK faga (V. kolere O1, O139).
5.2. Mutacije u bakterijama
Mutacije su promjene u slijedu pojedinačnih nukleotida DNA koje fenotipski dovode do takvih manifestacija kao što su promjene u morfologiji bakterijske stanice, pojava zahtjeva za čimbenicima rasta, na primjer, aminokiselinama, vitaminima, tj. auksotrofija, rezistencija na antibiotike, promjene u temperaturnoj osjetljivosti, smanjena virulencija (atenuacija) itd.
Mutacija koja rezultira gubitkom funkcije naziva se izravna mutacija. Mutanti mogu doživjeti obnovu svojih izvornih svojstava, tj. reverzija (od engl. obrnuti - nazad). Ako se izvorni genotip obnovi, tada se mutacija koja vraća genotip i fenotip naziva reverzna ili izravna reverzija. Ako mutacija vraća fenotip bez vraćanja genotipa, tada se takva mutacija naziva supresor. Supresorske mutacije mogu se pojaviti i unutar istog gena u kojem se pojavila primarna mutacija, iu drugim genima, ili mogu biti povezane s mutacijama u tRNA.
Na temelju opsega promjena oštećenja DNA razlikuju se točkaste mutacije, kada je oštećenje ograničeno na jednu
par nukleotida, i proširene ili aberacije. U potonjem slučaju može se uočiti gubitak nekoliko parova nukleotida, koji se nazivaju brisanje, dodavanje parova nukleotida, tj. dupliciranja kretanje fragmenata kromosoma, translokacije i preraspodjele parova nukleotida - inverzije.
Mutacije mogu biti spontano, tj. nastaje spontano, bez vanjskog utjecaja, i induciran.
Točka spontana mutacije nastaju kao posljedica pogrešaka tijekom replikacije DNA, što je povezano s tautomernim kretanjem elektrona u dušikovim bazama.
Timin (T), na primjer, obično se nalazi u keto obliku, u kojem može stvarati vodikove veze s adeninom (A). Ali ako se timin pretvori u enolni oblik tijekom sparivanja baza tijekom replikacije DNK, on se uparuje s gvaninom. Kao rezultat toga, u novoj molekuli DNK, na mjestu gdje je prethodno stajala par A-T, pojavljuje se par G-C.
Spontane kromosomske aberacije nastaju zbog kretanja mobilnih genetskih elemenata. Inducirane mutacije pojavljuju se pod utjecajem vanjski faktori koji se zovu mutageni. Mutageni su fizikalni (UV zrake, γ-zračenje), kemijski (analozi purinskih i pirimidinskih baza, dušična kiselina i njezini analozi i drugi spojevi) i biološki - transpozoni.
Analozi purinskih i pirimidinskih baza, na primjer 2-aminopurin, 5-bromuracil, uključeni su u nukleotide, a time i u DNK, ali je mnogo vjerojatnije da će se spariti s "pogrešnim" partnerima zbog tautomernih transformacija, što rezultira zamjenom purin s drugim purinom (A-D) ili pirimidin s drugim pirimidinom (T-C). Zamjena purina drugim purinom i pirimidina drugim pirimidinom naziva se prijelaz.
Dušična kiselina i njezini analozi uzrokuju deaminaciju dušikovih baza, što rezultira pogreškama tijekom sparivanja i, kao posljedicu, pojavom prijelaza. Adenin se, kao rezultat deaminacije, pretvara u hipoksantin, koji se spaja s citozinom, što dovodi do prijelaza AT-GC. Guanin, kada se deaminira, pretvara se u ksantin, koji se još uvijek spaja s citozinom; dakle, deaminacija guanina nije popraćena mutacijom.
Akridin i proflavin uvode se između susjednih baza lanca DNA, udvostručujući udaljenost između njih. Ova prostorna promjena tijekom replikacije može dovesti ili do gubitka nukleotida ili do uključivanja dodatnog para nukleotida, što rezultira pomak okvira čitanja tRNA. Počevši od mjesta gdje je došlo do gubitka ili uključivanja nukleotida, informacija se očitava netočno.
UV zračenje utječe pretežno na pirimidinske baze, a dva susjedna DNA timinska ostatka mogu postati kovalentno povezana.
Korištenjem bakterija izloženih UV zračenju, pokazalo se da se oštećenja uzrokovana zračenjem u bakterijskoj DNA mogu djelomično ispraviti zbog prisutnosti reparacije sustava Različite bakterije imaju nekoliko vrsta sustava popravka. Jedna vrsta popravka događa se na svjetlu i povezana je s aktivnošću fotoreaktivirajućeg enzima koji cijepa dimer timina. Tijekom tamnog popravka, neispravni dijelovi DNK lanca se uklanjaju, a nastala praznina se dovršava pomoću DNK polimeraze na predlošku preostalog lanca i povezuje se s lancem pomoću ligaze.
5.3. Rekombinacija kod bakterija
Genetska rekombinacija je interakcija između dviju DNK različitih genotipova, koja rezultira stvaranjem rekombinantne DNK koja kombinira gene oba roditelja.
Značajke rekombinacije u bakterijama određene su odsutnošću spolne reprodukcije i mejoze, tijekom koje se u višim organizmima javljaju rekombinacija i haploidni skup gena. Tijekom procesa rekombinacije bakterije se konvencionalno dijele na stanice donore, koje prenose genetski materijal, i stanice primatelje, koje ga primaju. Ne sav, već samo dio kromosoma stanice donora prodire u stanicu primatelja, što dovodi do stvaranja nepotpune zigote - merozigoti. Kao rezultat rekombinacije, u merozigoti se formira samo jedan rekombinant, čiji je genotip predstavljen uglavnom genotipom primatelja, s fragmentom donorskog kromosoma uključenog u njega. Ne nastaju recipročni rekombinanti.
Prema molekularnom mehanizmu, genetička rekombinacija kod bakterija dijeli se na homolognu, site-specific i nelegitimnu.
5.3.1. Homologna rekombinacija
U homolognoj rekombinaciji, tijekom procesa lomljenja i ponovnog ujedinjenja DNA, dolazi do razmjene između regija DNA koje imaju visok stupanj homologije. Proces homologne rekombinacije je pod kontrolom gena spojenih u R.E.C.- sustav koji se sastoji od gena recA, B, C, D. Produkti ovih gena odmotavaju DNA niti i preusmjeravaju ih kako bi formirali hemihijazmu, Holiday strukturu, a također režu Holiday strukturu kako bi dovršili proces rekombinacije.
5.3.2. Rekombinacija specifična za mjesto
Ova vrsta rekombinacije ne ovisi o funkcioniranju gena recA, B, C, D, ne zahtijeva proširene dionice homologije DNA, ali za čiji tijek su potrebni strogo definirani slijedovi DNA i poseban enzimski aparat koji je specifičan za svaki pojedini slučaj. Primjer ove vrste rekombinacije je integracija plazmida u bakterijski kromosom, koja se događa između identičnih IS elemenata kromosoma i plazmida, integracija DNA lambda faga u kromosom E. coli. Rekombinacija specifična za mjesto koja se događa unutar jednog replikona također je uključena u promjenu aktivnosti gena. Na primjer, kod Salmonella, posljedica ovog procesa su fazne varijacije u flagelarnom H-antigenu.
5.3.3. Nelegitimna ili replikativna rekombinacija
Nelegitimna ili replikativna rekombinacija ne ovisi o funkciji gena recA, B, C, D. Primjer toga je transpozicija mobilnih genetskih elemenata duž replikona ili između replikona, dok je, kao što je već navedeno u odjeljku 5.1.3, transpozicija mobilnog genetskog elementa popraćena replikacijom DNK.
Rekombinacija kod bakterija je završna faza prijenosa genetskog materijala između bakterija, koja se odvija pomoću tri mehanizma: konjugacije (kada bakterije dođu u kontakt,
od kojih jedan nosi konjugativni plazmid), transdukcija (pomoću bakteriofaga), transformacija (pomoću visoko polimerizirane DNA).
5.4. Prijenos genetske informacije u bakterijama5.4.1. Konjugacija
Prijenos genetskog materijala iz stanice donora u stanicu primatelja izravnim kontaktom stanica naziva se konjugacija, koju su prvi otkrili J. Lederberg i E. Tatum 1946. godine.
Nužan uvjet za konjugaciju je prisutnost transmisibilnog plazmida u stanici davatelja. Prijenosni plazmidi kodiraju spolne pilije, koje tvore konjugacijsku cijev između stanice donora i stanice primatelja, kroz koju se plazmidna DNA prenosi u novu stanicu. Mehanizam za prijenos plazmidne DNA iz stanice u stanicu je da poseban protein kodiran tra operonom prepoznaje specifičnu sekvencu u plazmidnoj DNA (zvanoj plazmidnoj DNA). porijeklo - početak), uvodi jednolančani prekid u ovu sekvencu i kovalentno se veže za 5" kraj. Zatim se lanac DNA na koji je vezan protein prenosi u stanicu primatelja, a neprekinuti komplementarni lanac ostaje u stanici davatelju. stanični aparat za sintezu DNA dovršava pojedinačne niti u donoru i u primatelju do dvolančane strukture. Protein povezan s 5" krajem prenesenog lanca doprinosi zatvaranju plazmida u stanici primatelja u prsten. . Ovaj proces je prikazan na sl. 5.3, te na primjeru prijenosa plazmida F u stanicu primatelja (s engl. plodnost - plodnost), koji je i transmisivni i integrativni plazmid. Donorske stanice koje imaju F faktor nazivaju se F + stanice, a stanice primatelja koje nemaju F faktor nazivaju se F - stanice. Ako je faktor F u stanici davatelja u autonomnom stanju, tada kao rezultat križanja F + * F - stanica primatelja dobiva svojstva davatelja.
Ako se F faktor ili drugi transmisivni plazmid umetne u kromosom stanice donora, tada plazmid i kromosom počinju funkcionirati kao jedan transmisivni replikon, što omogućuje prijenos bakterijskih gena u stanice bez plazme.
Riža. 5.3. Shema konjugacije kod bakterija: a - prijenos F plazmida iz F + - u F - stanicu; b - prijenos bakterijskog kromosoma Hfr* F-
srednja stanica primatelja, tj. proces konjugacije. Sojevi u kojima je plazmid u integriranom stanju visokom frekvencijom prenose svoje kromosomske gene u stanice bez plazmida i stoga se nazivaju Hfr(s engleskog visoka frekvencija od rekombinacija - visoka frekvencija rekombinacije) (Sl. 5.3, b).
Proces prijenosa kromosomskih gena u slučaju križanja Hfrχ F – uvijek počinje cijepanjem DNA na istoj točki – na mjestu integracije F faktora ili drugog transmisibilnog plazmida. Jedan lanac donorske DNK prenosi se preko konjugacijskog mosta u stanicu primatelja. Proces je popraćen završetkom komplementarne niti do stvaranja dvolančane strukture. Prijenos kromosomskih gena tijekom konjugacije uvijek ima isti smjer, suprotno od ugrađenog plazmida. Sam prijenosni plazmid prenosi se posljednji. Lanac DNK donora, prenesen u stanicu primatelja i dovršen u dvolančanu strukturu, rekombinira se s homolognom regijom DNK primatelja kako bi se stvorila stabilna genetska struktura. Zbog krhkosti konjugacijskog mosta, spolni faktor rijetko se prenosi u stanicu primatelja, stoga dobiveni rekombinant u pravilu nema donorske funkcije.
Zbog usmjerenosti prijenosa gena, konjugacija se koristi za mapiranje bakterijskog genoma i izradu genetske karte.
5.4.2. Transdukcija
Transdukcija je prijenos bakterijske DNA kroz bakteriofag. Ovaj proces su 1951. godine otkrili N. Zinder i J. Lederberg. Tijekom procesa replikacije faga unutar bakterija (vidi odjeljak 3.3), fragment bakterijske DNA ulazi u česticu faga i prenosi se na bakteriju primatelja tijekom infekcije fagom. Postoje dvije vrste transdukcije: general transdukcija - prijenos bakteriofagom segmenta bilo kojeg dijela bakterijskog kromosoma - nastaje zbog činjenice da je tijekom infekcije fagom bakterijska DNA fragmentirana, a fragment bakterijske DNA iste veličine kao DNA faga prodire u fag glavu, tvoreći neispravnu česticu faga. Ovaj se proces događa s učestalošću od približno 1 na 1000 čestica faga (slika 5.4, a). Kada je stanica primatelj zaražena neispravnom česticom faga, DNA stanice donora se "ubrizgava" u nju i rekombinira homolognom rekombinacijom s homolognom regijom kromosoma primatelja da bi se formirao stabilni rekombinant. P-fagi posjeduju ovu vrstu transdukcije. Specifično transdukcija se događa kada se DNA faga integrira u bakterijski kromosom i formira profage. U procesu isključivanja DNAfaga iz bakterijskog kromosoma, kao rezultat nasumičnog procesa, zarobljava se fragment bakterijskog kromosoma uz mjesto uključivanja fagne DNA, postajući defektni fag (slika 5.4, b). Budući da se većina umjerenih bakteriofaga integrira u bakterijski kromosom u određenim područjima, takve bakteriofage karakterizira prijenos određenog dijela bakterijske DNA iz stanice donora u stanicu primatelja. DNA defektnog faga rekombinira se s DNA stanice primatelja rekombinacijom specifičnom za mjesto. Rekombinant postaje merodiploid zbog unesenog gena. Konkretno, bakteriofag prenosi gen gal na E. coli.
Riža. 5.4. Shema transdukcije: a - nespecifična (opća); b - specifičan
5.4.3. Transformacija
Fenomen transformacije prvi je 1928. opisao F. Griffiths, koji je otkrio transformaciju akapsularnog R-soja pneumokoka. (Streptococcus pneumoniae) u soj koji tvori kapsulu u obliku slova S. Griffiths je istovremeno miševima ubrizgao mali broj avirulentnih R stanica i toplinom ubijenih S stanica. R stanice dobivene su iz soja čija je kapsularna tvar pripadala tipu S II, a toplinski ubijeni S sojevi pripadali su tipu S III.
Virulentni pneumokok sa S III kapsulom izoliran je iz krvi mrtvih miševa.
Godine 1944. O. Avery, K. McLeod i M. McCarthy ustanovili su prirodu faktora transformacije, pokazujući da DNA ekstrahirana iz inkapsuliranih pneumokoka može transformirati nekapsulirane pneumokoke u inkapsulirani oblik. Tako je dokazano da je DNK nositelj genetske informacije. Proces transformacije može se dogoditi spontano u prirodi kod nekih vrsta bakterija, B. subtilis, H. influenzae, S. pneumoniae, kada DNK ekstrahiranu iz mrtvih stanica preuzmu stanice primateljice. Proces transformacije ovisi o kompetenciji stanice primatelja i stanju transformirajuće DNK donora. Kompetencija -
ovo je moguće
Samo dvolančana, visoko spiralna molekula DNA ima transformirajuću aktivnost. To je zbog činjenice da samo jedan lanac DNA prodire u stanicu primatelja, dok drugi - na staničnoj membrani - prolazi kroz razgradnju uz oslobađanje energije, koja je potrebna da preostali lanac prodre u stanicu. Velika molekularna težina transformirajuće DNA povećava mogućnost rekombinacije, budući da je unutar stanice transformirajući lanac DNA izložen endonukleazama. Integracija s kromosomom zahtijeva prisutnost regija homolognih s njim u transformirajućoj DNA. Rekombinacija se događa na jednom lancu, što rezultira stvaranjem heterodupleksne molekule, od kojih jedan lanac ima genotip primatelja, a drugi ima rekombinantni genotip. Rekombinantni transformanti nastaju tek nakon ciklusa replikacije (slika 5.5).
Trenutno je ova metoda glavna metoda genetskog inženjeringa koja se koristi u konstrukciji rekombinantnih sojeva s danim genomom.
Riža. 5.5. Shema transformacije
5.5. Značajke genetike virusa
Osobitost strukture virusnog genoma je da se nasljedne informacije mogu zabilježiti i na DNK i na RNK, ovisno o vrsti virusa.
Mutacije u virusima mogu nastati spontano tijekom replikacije nukleinske kiseline virusa, kao i pod utjecajem istih vanjskih čimbenika i mutagena kao i kod bakterija.
Fenotipski, mutacije virusnog genoma očituju se promjenama antigenske strukture, nemogućnošću izazivanja produktivne infekcije u osjetljivoj stanici, osjetljivošću proizvodnog ciklusa na temperaturu, kao i promjenama oblika i veličine plakova koje virusi izazivaju. oblikuju u staničnoj kulturi pod agar premazom (vidi Poglavlje 3.2).
Svojstva virusa mogu se promijeniti kada nekoliko virusa istovremeno inficira osjetljivu stanicu, a promjene svojstava u takvim uvjetima mogu se pojaviti kao rezultat izmjene između materijala nukleinske kiseline koji pripadaju različitim virusima (genetska rekombinacija i genetska reaktivacija) i procesa koji nisu popraćena razmjenom genetskog materijala (komplementacija i fenotipsko miješanje).
Genetska rekombinacija javlja se češće kod virusa koji sadrže DNA. Među RNA virusima, opaža se kod onih koji imaju fragmentirani genom, na primjer, virus influence. Tijekom rekombinacije dolazi do razmjene između homolognih regija genoma.
Genetska reaktivacija promatrana između genoma srodnih virusa koji imaju mutacije u različitim genima. Kao rezultat preraspodjele genetskog materijala, formira se punopravni genom kćeri.
Nadopunjavanje događa se kada jedan od dva virusa koji inficiraju stanicu sintetizira nefunkcionalni protein kao rezultat mutacije. Ne-mutirani virus, sintetizirajući kompletan protein, nadoknađuje njegovu odsutnost u mutiranom virusu.
Fenotipsko miješanje promatra se kada, kada se osjetljiva stanica pomiješa s dva virusa, dio potomaka dobije fenotipske karakteristike svojstvene dvama virusima, zadržavajući isti genotip.
5.6. Primjena genetskih metoda u dijagnostici zaraznih bolesti
Genetske metode koriste se u praktične svrhe kako za otkrivanje mikroba u materijalu koji se proučava bez izolacije čiste kulture, tako i za određivanje taksonomskog položaja mikroba i provedbu intraspecifične identifikacije.
5.6.1. Metode korištene za intraspecifičnu identifikaciju bakterija
Restrikcijska analiza temelji se na upotrebi enzima tzv restrikcijski enzim Restrikcijski enzimi su endonukleaze koje cijepaju molekule DNA kidanjem fosfatnih veza ne na nasumičnim mjestima, već u specifičnim sekvencama nukleotida. Poseban značaj jer metode molekularne genetike imaju restrikcijske enzime koji prepoznaju sekvence sa centralna simetrija i čitati jednako u oba smjera od osi simetrije. Prijelomna točka DNA može se poklapati s osi simetrije ili biti pomaknuta u odnosu na nju.
Trenutno je više od 175 različitih restrikcijskih enzima izolirano i pročišćeno iz različitih bakterija, za koje su poznata (restrikcijska) mjesta (mjesta). Identificirano je više od 80 različitih tipova mjesta na kojima se mogu pojaviti lomovi dvostruke spirale DNA. Genom određene taksonomske jedinice sadrži strogo definiran (genetski određen) broj mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim. Ako se DNA izolirana iz određenog mikroba tretira određenim restrikcijskim enzimom, to će dovesti do stvaranja strogo određenog broja fragmenata DNA fiksne veličine. Veličina svake vrste fragmenata može se odrediti pomoću elektroforeze u agaroznom gelu: mali fragmenti kreću se brže kroz gel od većih fragmenata i imaju dužu udaljenost. Gel se boji etidijevim bromidom i fotografira pod UV svjetlom. Na taj način možete dobiti restrikcijsku kartu određene vrste mikroba.
Usporedbom restrikcijskih mapa DNA izolirane iz različitih sojeva, moguće je odrediti njihov genetski odnos, identificirati pripadnost određenoj vrsti ili rodu, te otkriti
živa područja podložna mutacijama. Ova se metoda također koristi kao početni stupanj metode određivanja redoslijeda parova nukleotida (sekvenciranja) i metode molekularne hibridizacije.
Određivanje plazmidskog profila bakterija. Profil plazmida omogućuje intraspecifičnu identifikaciju bakterija. Da bi se to postiglo, plazmidna DNA se izolira iz bakterijske stanice, koja se odvaja elektroforezom u agaroznom gelu kako bi se odredio broj i veličina plazmida.
Ribotipizacija. Slijed nukleotidnih baza u operonima koji kodiraju rRNA karakteriziran je prisutnošću i konzervativnih regija koje su prošle kroz manje promjene tijekom evolucije i imaju sličnu strukturu u različitih bakterija, i varijabilnih sekvenci koje su specifične za rod i vrstu i markeri su za genetsku identifikacija. Ovi operoni prisutni su na bakterijskom kromosomu u nekoliko kopija. Fragmenti DNA dobiveni nakon obrade restrikcijskim enzimima sadrže genske sekvence rRNA koje se mogu detektirati molekularnom hibridizacijom s obilježenom rRNA odgovarajuće bakterijske vrste. Broj i položaj kopija rRNA operona i sastav restrikcijskih mjesta unutar rRNA operona i duž njegovih bokova varira među različitim vrstama bakterija. Metoda se temelji na ovom svojstvušto omogućuje praćenje izoliranih sojeva i određivanje njihovog tipa. Trenutno se ribotipizacija provodi automatski u posebnim uređajima.
5.6.2. Metode koje se koriste za otkrivanje mikroba bez izolacije u čistu kulturu
Metoda molekularne hibridizacije omogućuje nam određivanje stupnja sličnosti između različitih DNA. Koristi se u identifikaciji mikroba kako bi se odredio njihov točan taksonomski položaj, kao i za otkrivanje mikroba u materijalu koji se proučava bez izolacije u čistu kulturu. Metoda se temelji na sposobnosti dvolančane DNA da denaturira na povišenim temperaturama (90 °C) u alkalnoj sredini, tj. razmotati u dvije niti, a kada temperatura padne za 10 °C ponovno vratiti izvornu dvolančanu strukturu. Metoda zahtijeva molekularnu sondu.
Sonda je jednolančana molekula nukleinske kiseline obilježena radioaktivnim nuklidima, enzimom ili fluorokromnom bojom, s kojom se uspoređuje DNK koja se proučava.
Da bi se izvršila molekularna hibridizacija, DNK koja se proučava razotkriva se na gore opisani način, jedan lanac se fiksira na poseban filter, koji se zatim stavlja u otopinu koja sadrži sondu. Stvoreni su uvjeti za obrazovanje dvostruke spirale. Ako postoji komplementarnost između sonde i DNA koja se testira, one međusobno tvore dvostruku spiralu, čija se prisutnost otkriva metodama koje ovise o vrsti oznake sonde: brojanjem radioaktivnosti, enzimski imunoanalizom (ELISA) ili denzitometrijom .
Utvrđivanje prisutnosti mikroba u ispitivanom materijalu pomoću mikročipa
Mikročip je staklena ploča s 100 do 1000 molekularnih DNA sondi povezanih s njim, koje predstavljaju niz nukleotida specifičnih za danu taksonomsku jedinicu, lokaliziranih u određenim područjima (Sl. 5.6).
Riža. 5.6. Princip otkrivanja specifične DNA sekvence pomoću mikročipa
Iz uzorka se izolira ukupna DNA, koja se može umnožiti iz stabilne sekvence gena 16S RNA. Izolirana DNA obilježena je fluorokromom ili enzimom i njime se tretira mikročip, čime se stvaraju uvjeti za hibridizaciju. Nevezana DNA se ispire, a lokalizacija molekularnih hibrida utvrđuje se ELISA-om ili denzitometrijom.
Lančana reakcija polimeraze omogućuje vam otkrivanje mikroba u materijalu koji se proučava (voda, proizvodi, materijal od pacijenta) prisutnošću mikrobne DNK u njemu bez izolacije potonjeg u čistu kulturu.
Da bi se provela ova reakcija, DNK se izolira iz materijala koji se proučava, u kojem se utvrđuje prisutnost gena specifičnog za određeni mikrob. Gen se otkriva po njegovoj akumulaciji. Da bi se to postiglo, potrebno je imati početnice (seeds) komplementarne 3"-krajevima DNA izvornog gena. Akumulacija (amplifikacija) gena se izvodi na sljedeći način. DNA izolirana iz test materijala se zagrijava. U ovom slučaju, prajmeri se raspadaju na 2 lanca , DNA polimeraza i nukleotidi se dodaju u smjesu DNA i primera nukleotida na 3" krajeve početnica, što rezultira sintezom dviju kopija gena. Nakon toga, ciklus se ponovno ponavlja, pri čemu se količina DNA gena svaki put udvostručuje (slika 5.7). Reakcija se provodi u posebnim uređajima - pojačivačima. Rezultat se procjenjuje naknadnom denzitometrijom amplificirane DNA ili njezinom elektroforezom u poliakrilamidnom gelu. PCR se koristi za dijagnosticiranje virusnih i bakterijskih infekcija.
PCR u stvarnom vremenu predstavlja ubrzanu PCR metodu u kojoj se amplifikacija i određivanje produkta amplifikacije provode istovremeno. U tu se svrhu u cijev za pojačavanje uvodi molekularna sonda koja, vezana za pojačani lanac, stvara fluorescentni signal određene valne duljine. Reakcija se odvija automatski.
Riža. 5.7. Lančana reakcija polimerazom (shema)
Amplifikacija posredovana transkripcijom rRNA se koristi za dijagnosticiranje miješanih infekcija. Ova se metoda temelji na detekciji molekularnom hibridizacijom umnoženih rRNA specifičnih za određenu bakterijsku vrstu. Studija se provodi u tri faze:
Umnožavanje skupa rRNA na matrici DNA izolirane iz ispitivanog materijala pomoću DNA-ovisne RNA polimeraze;
Hibridizacija akumuliranog skupa rRNA s komplementarnim rRNA oligonukleotidima specifičnim za vrstu obilježenim fluorokromom ili enzimima;
Određivanje produkata hibridizacije denzitometrijom i ELISA testom.
Reakcija se provodi automatski u instalacijama u kojima se istovremeno određuje pripadnost rRNA razne vrste bakterija, postiže se dijeljenjem amplificiranog skupa rRNA u nekoliko uzoraka, u koje se dodaju označeni oligonukleotidi komplementarni rRNA specifičnoj za vrstu za hibridizaciju.
Otkriveni su viši organizmi, onkogeni itd. (vidi Migracijski genetski elementi).
IS ELEMENTI I TRANSPOZONI U BAKTERIJAMA
Transpozoni, zajedno s plazmidima i fagima (u koje se lako integriraju), sposobni su razmjenjivati različite gene sadržane u njima između vrlo udaljenih vrsta bakterija, stoga igraju iznimno važnu ulogu u evoluciji bakterija, uključujući njihovu prilagodbu na lek . u vama i njihovu proizvodnju novih otrova.
Transpozoni i 15-elementi odgovorni su za niz genetskih fenomena u bakterijama. Umetanje prijenosnog elementa u gen može dovesti do njegove inaktivacije. Osim toga, neki IS elementi i transpozoni uzrokuju genetsku nestabilnost u blizini mjesta svoje lokalizacije u blizini elementa, učestalost delecija i inverzija primjetno se povećava, a jedna od granica preraspodjele uvijek se poklapa s jednim od krajeva 15-element, autonoman ili kao dio transpozona. Mobilni elementi također mogu uzrokovati translokacije. Doista, dva IS elementa koji se nalaze na određenoj udaljenosti jedan od drugoga mogu se smatrati transpozonom, a takvi transpozoni su doista sposobni kretati se kao jedna jedinica, iako je barem za neke IS elemente pokazano da je učestalost kretanja takvog kompozitna struktura se brzo smanjuje s povećanjem udaljenosti između bočnih IS elemenata.
Slični paradoksi. može se razriješiti ako se prisjetimo da i plazmidi i mobilni genetski elementi imaju komparativnu autonomiju od većine genetskog materijala, te se stoga mogu smatrati vrstom organizama koji žive u posebnom, genetskom okruženju. Stoga se funkcije plazmida, IS elemenata i transpozona mogu razmatrati ne sa stajališta prednosti koje oni donose bakterijama domaćinima, već sa stajališta njihovog samoodržanja u populacijama bakterija, drugim riječima, može smatrati autonomnim elementima prokariota sebične DNK, koja osigurava prvi red vlastite reprodukcije. U ovom smislu. pokretni elementi i plazmidi su neposredno uz viruse, čije su sebične tendencije očite.
Koji se geni pokazuju korisnima i uključeni su u pokretne elemente. Ovo nije prazno pitanje, budući da je svaka bakterijska stanica dobro prilagođena svojoj okolini i ne trebaju gene slične onima koje već ima i osiguravaju njezinu prilagodbu na okruženje. S druge strane, čini se da prilagodba na potpuno novu okolinu zahtijeva relativno značajnu reorganizaciju genetskog materijala stanice, uključujući, posebno, ko-prilagodbu mnogih različitih gena. Dakle, stanica može steći selektivnu prednost stjecanjem gena (kao dijela transpozona) samo ako je sam gen sposoban biti koristan za bakteriju pod određenim uvjetima, tj. upravo su ti geni korisni za transpozone. imati u svom sastavu. Doista, geni za otpornost na razne bakterijske otrove, uključujući teške metale i antibiotike, putuju transpozonima, geni za dodatne metaboličke putove, omogućujući korištenje, na primjer, nekih neobičnih, i konačno, geni za neke toksine, čineći bakterije patogenima i čime im omogućujete da značajno promijene vaš stil života.
| Riža. 15.13. Identifikacija transpozona elektronskim mikroskopskim ispitivanjem heterodupleksa. Kako bi transpozon bio vidljiv, DNK bakterije divljeg tipa (B) i bakterije koja nosi transpozon (A) se zagrijavaju, uzrokujući odvajanje (otapanje) dvostrukih spiralnih lanaca. S kasnijim polaganim hlađenjem smjese dolazi do sparivanja komplementarnih baza pojedinačnih DNA lanaca A i B, što dovodi do stvaranja heterodupleksa DNA. Ako na krajevima transpozona postoje suprotno orijentirani komplementarni IS elementi, tada se i te regije spare i tvore stabljiku, na kojoj bočno strši srednji dio transpozona u obliku petlje od jedne niti. |
Bakterijski transpozoni imaju sličnu strukturnu organizaciju (slika 2.1). Svi su ograničeni terminalnim invertiranim ponavljanjima, čija duljina i sastav variraju među različitim transpozonima (od deset do nekoliko stotina bp). Međutim, za određeni transpozon oni su jedinstvene konstante, tj. ne mijenjaju se kada se on unese na različita mjesta. Karakteristična značajka bakterijskih transpozona je i zbog činjenice da su na oba kraja ograničeni izravnim ponavljanjima primateljske DNA (ciljna DNA). Duljina ovih ponavljanja varira od 5 do 9 bp, ali je za pojedini element konstantna. Redoslijed nukleotida u ponavljanjima određen je položajem elementa. Na mjestima neovisnog podrijetla, transpozon je okružen ponavljanjima različitog sastava.
Mutacije uzrokovane transpozonima. U bakterijskoj genetici, metoda dobivanja mutacija pomoću trans-pozona postaje sve važnija. Transpozoni (Tn) su kratki dvostruki lanci DNA koji se sastoje od više od 2000 parova baza i obično uzrokuju rezistenciju na jedan antibiotik, u iznimnim slučajevima na nekoliko transpozona koji mogu skakati iz jedne regije genoma u drugu, posebice iz a bakterijskog kromosoma u plazmid i natrag na taj način, mogu biti uključeni u različite dijelove genoma (vidi odjeljak 15.3.1) Ako se transpozon uvede u bilo koji strukturni gen kromosoma, nukleotidna sekvenca tog gena bit će prekinuta. a genetska informacija se neće moći prevesti u funkcionalni potpuni polipeptid. Pojavit će se insercijski mutant.
Gore je spomenuto da mobilni elementi uzrokuju genetsku nestabilnost u blizini mjesta njihove lokalizacije. Ova značajka se lako objašnjava već poznatim svojstvima IS elemenata i transpozona bakterija. Slika 80 prikazuje što se događa kada se transpozon tipa Tn3 kreće unutar jednog replikona, tj. s replikativnim mehanizmom transpozicije. Ovisno o tome kako su prekidi uvedeni u ciljnu DNK, dobit ćete ili brisanje ili inverziju genetskog materijala između lokacije transpozona i cilja njegovog kretanja. Zapravo, stvaranje delecije nalikuje procesu raspadanja kointegrata, ali budući da jedna od rezultirajućih molekula DNK nema ishodište replikacije, ona se gubi. Ako dođe do inverzije, tada se na obje njegove granice nalazi kopija transpozona u orijentaciji invertiranoj jedna u odnosu na drugu. Stoga je stvaranje delecija i inverzija karakteristično za replikativni mehanizam transpozicija.
Ključno svojstvo bakterijskih prijenosnih elemenata koje osigurava njihovo očuvanje je njihova sposobnost prelaska s replikona na replikon. Prisutnost transmisivnih i mobilizirajućih plazmida u bakterijama omogućuje transpozonima i IS elementima ne samo da se kreću od plazmida do plazmida ili od kromosoma do plazmida, već i da putuju od stanice do stanice kao dio plazmida. Na taj se način mobilni elementi mogu širiti kroz populaciju bakterija čak i ako ne pružaju nikakvu korist svojim domaćinima. U tom smislu, vrijedi spomenuti fenomen imunosti na transpoziciju; mnogo je vjerojatnije da će se mnogi transpozoni i elementi IS preseliti na nove replikone nego na novo mjesto u replikonu u kojem se nalaze. Molekularni mehanizam ovog svojstva još nije razjašnjen, ali je očito da doprinosi distribuciji mobilnog elementa kroz najveći broj replikoni.
Identični IS elementi i transpozoni smješteni na različitim replikonima sposobni su olakšati homolognu rekombinaciju, što dovodi do stvaranja kointegrata. Na taj se način neki plazmidi reverzibilno integriraju u bakterijski kromosom, što odmah osigurava dodavanje značajnog fragmenta genetskog materijala (slika 82). Plazmidi koji se mogu umetnuti u bakterijski kromosom i odatle izrezati nazivaju se epizomi. Ponekad se ekscizija epizoma može dogoditi na drugom paru IS elemenata od onog kroz koji se integracija dogodila. U tom slučaju plazmid može uhvatiti dio kromosomskog materijala i dio njegove DNA
Plazmid koji nosi modificirani transpozon Tn5 s integriranim genom za toksin uveden je u bakteriju u kojoj je transpozon divljeg tipa Tn5 umetnut u njenu kromosomsku DNA.
Nekromosomski genetski plazmidni elementi, umjereni fagi i migratorni elementi (transpozoni i 15-elementi) pronađeni su u mnogim bakterijama. Plazmide karakterizira stabilno postojanje u nekromosomskom stanju. Transpozoni i 15-elementi su, u pravilu, dio kromosoma, ali su sposobni prijeći s kromosoma na plazmid, pa se stoga mogu klasificirati i kao nekromosomski genetski elementi.
Transpozoni mogu poslužiti kao marker za gen namijenjen kloniranju. Kao što je poznato, kod kloniranja kromosomskih gena bakterija ponekad nastaju poteškoće zbog činjenice da ne postoji jednostavna metoda kojom bi se utvrdilo koji od plazmida koji nosi integrirani fragment kromosomske DNA sadrži gen od interesa za istraživača. Ponekad se ovaj problem može riješiti tako da se prvo izolira mutant za ovaj gen s transpozonom uključenim u njega ili smještenim u blizini.
Kromosomska DNK prokariotskih i eukariotskih stanica također sadrži kontrolne ili takozvane "skačuće" mobilne gene - transpozone (Tn), koje je prvi otkrio B McClintock 1940. godine u kukuruzu. Oni se nalaze na znatnoj udaljenosti od drugih gena koji su pod utjecajem mutacije, nazvane "eksplozije transpozona", moguće je masovno i, u određenoj mjeri, usmjereno kretanje genetskih elemenata. Transpozoni su sposobni za replikaciju i umetanje (umetanje) u obliku jedne od kopija na novo mjesto u genomu. (jezgra DNA) Kod bakterija pretežni dio transpozona kodira enzim
Smatraju se mutagenim čimbenicima biološke prirode mobilni (= migrirajući ) genetski elementi bakterija – diskretni segmenti DNA sposobni za neovisno kretanje iz jedne regije u drugu unutar replikona, kao i kretanje iz jednog replikona (kromosomskog, plazmidnog ili fagnog) u drugi. Ti elementi uključuju: jednostavne insercijske sekvence (IS elementi), transpozone (Tn elementi) i fagne transpozone (Mu, D3112, itd.). Njihova integracija u replikone odvija se neovisno o sustavu opće stanične rekombinacije, što zahtijeva obveznu homologiju u rekombinirajućim strukturama.
IS elementi su linearni fragmenti dvolančane DNA duljine od 200 do 2000 bp. Sadrže samo gene tnp, koji kodira sintezu enzima transpozaze potrebnog za njihovu migraciju (transpoziciju). Na krajevima IS elemenata nalaze se invertirana terminalna ponavljanja (ITR). Za različite IS elemente, duljina terminalnih ITR ponavljanja varira od 8 do 40 bp. Invertirana ponavljanja također su uključena i važna za transpoziciju. Struktura IS elementa može se shematski prikazati na sljedeći način:
Postoji nekoliko tipova IS elemenata: IS1, IS2, IS3, IS4 itd. Međusobno se razlikuju po duljini i strukturi završnih ponavljanja.
IS elementi su normalne komponente bakterijskih kromosoma i plazmida. Različiti replikoni mogu sadržavati različite, a često i višestruke, brojeve kopija IS elemenata. IS elementi mogu se kretati iz jedne regije genoma u drugu, na primjer, iz bakterijskog kromosoma u plazmid ili iz plazmida u plazmid. Oni također mogu umetnuti unutar jednog gena i deaktivirati ga ili promijeniti njegovu regulaciju.
Transpozoni – složeni migrirajući elementi. Označeno kao Tn 1, Tn 2,… Tn100, Tn 1002 itd. Razlikuju se od IS elemenata po tome što, osim gena odgovornih za transpoziciju, sadrže i strukturne gene koji su odgovorni za manifestaciju bilo kojeg fenotipa. Transpozoni mogu kontrolirati otpornost na antibiotike i ione teških metala, sposobnost katabolizacije laktoze, rafinoze, razgradnje toluena, sintezu enterotoksina itd., pa ih je lakše detektirati od IS elemenata. Duljina transpozona je preko 2000 bp. Poput IS elemenata, transpozoni imaju invertirana terminalna ponavljanja (ITR), koja su često IS elementi. Transpozoni se razlikuju ne samo po svojoj strukturi i sastavu, već i po stupnju specifičnosti u izboru mjesta integracije u replikone. Međutim, treba napomenuti da specifičnost transpozicije istog transpozona za različite bakterijske vrste i replikone može biti različita.
Učestalost migracije transpozona i IS elemenata događa se s vjerojatnošću od 10 –4 –10 –7 po diobi bakterijske stanice. Može ovisiti o prirodi replikona donora i primatelja, kao i o genomu stanice domaćina. Osim toga, na kretanje transpozona mogu utjecati čimbenici vanjsko okruženje(temperatura, UV zrake, kemijski spojevi itd.). Mehanizmi kretanja transpozona nisu u potpunosti shvaćeni.
Bakteriofag Mu spada u umjerene bakteriofage. Njegova karakteristična značajka je mutagenost, što se odražava u nazivu Mu (mu tator). Ovaj bakteriofag je prvi put otkriven kod bakterija E. coli, ali se razmnožava i na stanicama šigela, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter, Salmonela itd. Klasificira se kao mobilni genetski element, budući da je u mnogočemu sličan IS elementima i transpozonima, a bitno se razlikuje samo po tome što može tvoriti virusne čestice. Sličnost s IS elementima i transpozonima prvenstveno se izražava u činjenici da genom Mu faga (linearna dvolančana DNA - 38 kb) također ima invertirana ponavljanja na krajevima, ali samo od samo dva para nukleotida.
Sredinom 70-ih godina XX. stoljeća. otkriveni su mobilni genetski elementi. Oni su segmenti DNA sposobni za transpoziciju (kretanje) unutar istog ili različitih genoma. Na temelju stupnja strukturne složenosti razlikuju se tri vrste migrirajućih genetskih elemenata: IS elementi (od engleskog, inserciona sekvenca), transpozoni (Tn elementi) i neki bakteriofagi, posebice Mu fag.
Najjednostavnije genetske strukture sposobne za transpoziciju su IS elementi. Njihova veličina u prosjeku iznosi 750-1500 parova nukleotida (bp). Sadrže samo gene koji im omogućuju kretanje. U strukturi IS elemenata razlikuju se središnji dio i granični (bočni) terminalni ponavljači. U središnjem dijelu nalaze se geni koji kodiraju sintezu proteina potrebnih za transpoziciju. Završni dijelovi predstavljeni su ponavljajućim nukleotidnim sekvencama, duljine 8-40 bp. Ponavljanja imaju suprotnu orijentaciju jedna od druge i nazivaju se invertirana ponavljanja. Oni služe obilježje razni migratorni genetski elementi.
Struktura završnih ponavljanja određuje veličinu duplikacija (udvostručenja) DNA na mjestima gdje se uvode IS elementi. Dakle, element IS 1 koji se nalazi u kromosomu E. coli-K12 sastoji se od 768 bp, tvoreći invertirana ponavljanja duga 30 bp na krajevima. svaki. Svaki IS element ima svoj vlastiti slijed nukleotida i može biti uključen u DNA bakterija, plazmida i faga u bilo kojoj orijentaciji, uzrokujući inaktivaciju pojedinih strukturnih gena i, kao posljedicu, mutacije genoma ili poremećaj regulatornih funkcija operona. Bakterijski kromosom može istovremeno sadržavati nekoliko kopija istog IS elementa. Kretanje IS elemenata inducira različite vrste kromosomskih preraspodjela – duplikacije, inverzije, delecije.
Transpozoni ili Tn elementi - mobilni genetski elementi sadrže gene za fenotipska svojstva bakterija i gene
vlastita transpozicija. Oni se mogu ugraditi u različite dijelove kromosoma ili u izvankromosomske genetske strukture. Transpozoni se od IS elemenata razlikuju po složenijoj organizaciji, a neki sadrže IS elemente.
Transpozoni se dijele u dvije klase: A i B (slika 10.4). Transpozoni klase A (Tn 5) u središnjem dijelu sadrže strukturne gene koji određuju fenotipska svojstva, na primjer otpornost bakterija na antibiotike, a transpozicijski geni sadržani su u terminalnim invertiranim ponavljanjima, koji su elementi IS. U transpozonima klase B (Tn 3) središnji dio ne sadrži samo gene za fenotipska svojstva, već i gene za transpoziciju. Njihova završna ponavljanja puno su kraća i ne mogu obavljati transpozicijske funkcije. Ove funkcije obavljaju dva gena u središnjem dijelu. Razlike između transpozona klase A i klase B također leže u veličini duplikacija koje nastaju kada se uvedu u plazmide ili kromosome: prvi tvore duplikacije od 9 parova nukleotida, a drugi samo 5.
Riža. 10.4. Shema strukture transpozona klase A i klase B: IP - invertirana ponavljanja; GT - transpozicijski geni; GFP - geni fenotipskih svojstava
Transpozoni su znatno veći od IS elemenata i prosječno imaju 3500-15000 parova nukleotida. Dakle, ukupna duljina transpozona Tn 5 je 5800 bp, od čega je 1500 bp pada na obrnute terminalne ponavljanja. Tp 5 kodira pet proteina. Od njih, jedan protein je kodiran središnjim dijelom, a dva proteina su kodirana terminalnim ponavljanjima. Transpozon Tn 5 određuje otpornost na kanamicin, neomicin i druge srodne antibiotike.
Kretanje transpozona, kao i IS elemenata, može rezultirati različitim kromosomskim preraspodjelama: delecijama, inverzijama, translokacijama, duplikacijama. Osim toga, kretanje transpozona između dva različita replikona (dva plazmida ili plazmida i kromosoma) može uzrokovati spajanje ovih replikona u kointegrate. Naknadna rekombinacija specifična za mjesto dovodi do podjele kointegrata u dva replikona uz uključivanje jedne kopije transpozona u svaki replikon. Regulaciju transpozicije provode vlastiti geni MGE i kromosomski geni bakterije domaćina.
Umjereni fag Mu, izoliran 1963. iz kulture Vibrio cholerae, također ima MGE svojstva. Međutim, za razliku od IS elemenata i transpozona, ne sadrži ni izravne ni invertirane nukleotidne sekvence na krajevima genoma. Završna ponavljanja Mu faga čine fragmente DNK stanice domaćina u kojoj se fag razvio. Stanična DNA vezana je za genom faga tijekom njegove reprodukcije i gubi se tijekom integracije u novo mjesto. Jedinstvena sposobnost Mu faga je prijenos bakterijskih gena u različite dijelove kromosoma ili plazmida stanice primatelja. Phage Mu obavlja stalnu transpoziciju tijekom cijelog litičkog ciklusa. Nije specifičan za kromosomski lokus i može se spontano ugraditi na različita mjesta duž cijelog kromosoma, uzrokujući mutacije kromosomskih gena. Zbog svoje visoke aktivnosti u izazivanju mutacija dobio je ime Mu (od engleskog, mutator).
Unatoč nekim razlikama u strukturna organizacija, zajedničko svojstvo MGE-a je njihova sposobnost prodiranja u mnoga područja kromosomske ili plazmidne DNA, uzrokujući mutacije i razne preraspodjele gena. MGE također služe kao specifična mjesta za uvođenje plazmida u kromosome. Kroz MGE dolazi do rekombinacije između nehomologne DNA. Privremenu regiju homologije stvara MGE,
uključeni u jednu ili drugu regiju kromosoma ili plazmida
DNK.
Migrirajući genetski elementi, inducirajući genske i kromosomske preraspodjele, značajno doprinose redistribuciji genetskih informacija, daju bakterijama selektivne prednosti u određenim životnim uvjetima te imaju značajan utjecaj na razvoj i evoluciju mikrobnih vrsta.
2. Mutacija. Mutacije u bakterijama. Mutageni. Spontane mutacije. Povratne mutacije (reverzije).
3. Inducirane mutacije bakterija. Kemijska mutageneza. Radijacijska mutageneza. Vrste mutacija.
4. Popravak bakterijske DNA. Sustavi popravka DNA. Kompenzacija za funkcije oštećene kao rezultat mutacija. Intragensko potiskivanje. Ekstragensko potiskivanje.
5. Prijenos bakterijske DNA. Konjugacija bakterija. F-faktor bakterija.
6. Transformacija bakterija. Faze bakterijske transformacije. Mapiranje bakterijskih kromosoma.
7. Transdukcija. Nespecifična transdukcija. Specifična transdukcija. Abortivna transdukcija. Fenomen lizogenije.
8. Svojstva bakterija. Nenasljedne promjene u svojstvima bakterija. S - kolonije. R - kolonije. M - kolonije. D - kolonije bakterija.
Migrirajući genetski elementi- pojedinačni dijelovi DNA koji su sposobni izvršiti vlastiti prijenos (transpoziciju) unutar genoma. Transpozicija je povezana sa sposobnošću migrirajućih elemenata da kodiraju specifični rekombinacijski enzim - transpozazu.
Sekvence umetanja [IS elementi(Englesko umetanje, umetanje, + slijed, slijed)] - najjednostavniji tip migrirajućih elemenata (Sl. 4-15, A); njihova vrijednost ne prelazi 1500 parova baza (u prosjeku 800-1400). IS elementi ne repliciraju se neovisno i ne kodiraju prepoznatljiva fenotipska svojstva. Geni koje sadrže samo osiguravaju njihovo kretanje iz jednog područja u drugo.
Osnovne funkcije IS nizova- regulacija aktivnosti gena bakterijske stanice (mogu inaktivirati gene u koje su uključeni ili, kada su integrirani u kromosom, ispoljavati promotorski učinak koji uključuje ili isključuje transkripciju odgovarajućih gena), izazivanje mutacija kao npr. delecije ili inverzije (kada su premještene) i duplikacije (kada su integrirane u kromosom), koordinacija interakcija plazmida, traspozona i profaga (i među sobom i bakterijskim kromosomom).
Riža. 4-15 (prikaz, ostalo). Insercijska sekvenca (A), transpozon (B).Transpozoni(Tn elementi) sastoje se od 2000-25 000 parova nukleotida, sadrže fragment DNA koji nosi specifične gene i dva krajnja IS element(Sl. 4-15, B). Kada su uključeni u DNK bakterije, transpozoni uzrokuju duplikacije, kada izlaze iz određene regije DNK, uzrokuju brisanja, kada izađu i umetnu se natrag uz rotaciju fragmenta za 180 stupnjeva, uzrokuju inverziju. Transpozoni nisu sposobni za neovisnu replikaciju i množe se samo kao dio bakterijskog kromosoma.
Svaki transpozon obično sadrži gene koji daju karakteristike važne za bakteriju, kao što je višestruka otpornost na antibakterijska sredstva. Budući da transpozoni sadrže gene koji određuju fenotipski izražene osobine (na primjer, otpornost na antibiotike), lakše ih je detektirati od IS elemenata. Općenito, transpozone karakteriziraju isti geni kao i plazmide (geni za otpornost na antibiotike, stvaranje toksina, dodatni metabolički enzimi).
Umjereni i defektni bakteriofagi također mogu biti faktori varijabilnosti, nalikujući integriranim plazmidima po svojim svojstvima. Integracijom u bakterijski kromosom u obliku profaga (provirusa) uzrokuju lizogenizaciju bakterija koje mogu dobiti nova svojstva.
Bakteriofagi kao migratorni genetski elementi. U nekim situacijama, umjereni ili defektni fagi mogu biti čimbenici varijabilnosti, budući da se mogu integrirati u kromosom (stanje profaga) i napustiti ga, ponekad zarobivši gene kromosoma stanice domaćina (vidi odjeljak “Transdukcija”). Na primjer, u-bakteriofag je sličan IS elementima i transpozonima, budući da se može ugraditi u gotovo bilo koji dio bakterijskog kromosoma, unoseći svoj genetski materijal i izazivajući mutageni učinak. Zadržavajući sva tipična svojstva faga, p-bakteriofag se može smatrati ogromnim transpozonom.